刘鑫雅，李丹阳，赵利梅，卢士宇，卢文成，梁昌友，倪俊卿，马亚宾2,

（1.河北品元畜禽育种有限公司，石家庄 050000；2.河北省种畜禽质量监测站DHI（奶牛生产性能测定）中心，石家庄 050061；3.河北省畜牧良种工作站，石家庄 050061；4.遵化市农业畜牧水产局，遵化 064200；5.唐山市丰南区钱营镇人民政府，丰南 053301）

河北省规模奶牛场夏季乳房炎致病菌感染情况分析

刘鑫雅1,2，李丹阳1,2，赵利梅1,2，卢士宇1,2，卢文成4，梁昌友5，倪俊卿3，马亚宾2,3

（1.河北品元畜禽育种有限公司，石家庄 050000；2.河北省种畜禽质量监测站DHI（奶牛生产性能测定）中心，石家庄 050061；3.河北省畜牧良种工作站，石家庄 050061；4.遵化市农业畜牧水产局，遵化 064200；5.唐山市丰南区钱营镇人民政府，丰南 053301）

本试验在河北省345个参加DHI的奶牛场中，随机抽取27个奶牛场，选择患有乳房炎且临床症状明显的50头泌乳牛，利用自动实时PCR分析系统将纯化的细菌DNA扩增至检测水平，使用荧光定量仪对16种引起乳房炎的主要病原菌进行鉴定和定量。结果显示，在6月份和8月份的两次监测中，引起奶牛临床乳房炎的16 种主要致病菌全部被检出，其中检出率最高的是葡萄球菌属，检出率达42.42%、100% ；其次为含β-内酰胺酶基因的葡萄球菌和酵母菌，检出率分别为41.03%、92.85%和33.33%、64.28%；牛棒状杆菌和黏质沙雷菌，6月份未检出，8月份检出率较低。结果表明，试验奶牛场的夏季奶牛临床乳腺炎是由两种或几种致病菌混合感染引起的，其中葡萄球菌属和β-内酰胺酶基因的葡萄球菌检出率最高。

奶牛；乳腺炎；致病菌；分析

奶牛乳房炎是由物理、化学或微生物等因素刺激奶牛乳腺所发生的一种炎症反应[1]，其中多种病原微生物的感染是主因，是危害奶牛养殖业最严重的一种疾病。国外报道奶牛乳房炎的发病率为25%～60%，数据显示，我国奶牛乳房炎的发病率为20%～75%，其中临床乳房炎发病率为9.7%～55.6%，隐性乳房炎的发病率高达61.03%～79.62%[2]。奶牛乳房炎不仅导致奶牛产奶量和奶品质降低、淘汰率增加[3,4]，而且病原性乳房炎患牛的奶还含有大量的毒素、病原微生物及药物残留，食用后会引起呕吐、腹泻、发热、过敏等反应，影响人类健康[3～5]。

为更好地防控奶牛乳房炎，避免不合理用药造成的损失，本试验通过自动实时PCR分析系统将纯化的细菌DNA扩增至检测水平，应用荧光定量仪对16种主要乳房炎致病菌进行了鉴定和定量监控分析。

1 材料与方法

1.1 试验动物

以在河北省DHI中心实验室连续参加测定的345个规模化牧场为对象，随机选择27个牧场为试验牛场，选择6月份和8月份参测且具有临床乳房炎特征的泌乳牛50头为试验动物，其中6月份选择牧场：邯郸1个、石家庄12个；8月份选择牧场：邢台2个、廊坊3个、保定5个、石家庄2个、张家口1个、沧州1个；共计采集牛奶样品150份。

1.2 器材与试剂

器材：取样器，由北京鑫塔兴农科技有限公司生产；金属孵育器、离心机、移液枪、振荡器均由赛默飞世尔生物化学制品（中国）有限公司生产；短时离心机，由威泰克（Wealtec）有限公司生产；QIAamp提取柱、离心管（15mL、1.5mL）、96孔PCR反应板、8联管光学平盖均由北京牧欣科技发展有限公司生产；Thermo Scientific 奶牛乳腺炎病原菌PCR 分析系统由赛默飞世尔生物化学制品（中国）有限公司生产。

试剂：小抽试剂盒、PCR试剂盒均由北京牧欣科技发展有限公司生产；乙醇（100%）由天津市致远化学试剂有限公司生产。

1.3 试验设计

1.3.1 样品采集

采集奶样35～40mL（取样瓶中不含防腐剂），每个样品采集3份，4℃保存，48h内送至DHI实验室。

1.3.2 DNA 提取

按小抽试剂盒操作说明进行DNA提取。

1.3.3 PCR 反应体系配制

取4支1.5mL离心管，分别标记R1、R2、R3、R4，用于配制4个不同PCR反应体系；在4支离心管中各加入350μL PCR 预混液；对应4支离心管上的编号，依次分别加入各反应的引物混合液（PathoProof Primer Mix 1～4）180μL/支；将R1～R4管涡旋振荡混匀，离心10s；取一块96孔PCR反应板，配制PCR反应体系，阳性组的后4个孔做阴性对照；在对应的每个反应孔中加入5μL已提取好的DNA，阴性对照加入5μL灭菌水。

1.3.4 荧光定量 PCR

取8联管光学平盖，将所有盛有试剂的反应管封闭；将96孔板置于板式离心机，3 000r/min，离心3min；将离心后的96孔板置荧光定量PCR仪上进行扩增检测反应。

1.3.5 病原菌监测种类

金黄色葡萄球菌、葡萄球菌属（包括所有主要的凝固酶阴性葡萄球菌）、无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌、大肠杆菌、肠球菌属（包括粪肠球菌和屎肠球菌）、克雷伯菌属（包括产酸克雷伯菌和肺炎克雷伯菌）、黏质沙雷菌、牛棒状杆菌、化脓隐秘杆菌和吲哚嗜胨菌（消化链球菌属）、含β- 内酰胺酶基因的葡萄球菌、牛支原体、支原体属、酵母菌、原壁菌属，共计16种。

1.3.6 结果判定

判定标准：按多种病原菌在混合生长情况下存在比例进行判定。

2 结果与分析

图1 2016年6月份、8月份乳房炎病原菌监测情况

由表1和图1可以看出，2016年6月份、8月份16种奶牛乳房炎致病菌监测情况显示，葡萄球菌属（包括血浆凝固酶阴性葡萄球菌）的检出率最高，6月份的检出率为42.42%，8月份的检出率为100%；其次是含β-内酰胺酶基因的葡萄球菌，检出率分别为92.85%、41.03%；酵母菌6月份检出率为33.33%，8月份检出率为64.28%；大肠杆菌8月份的检出率比6月份高，达到64.28%。

3 讨论

表1 2016年6月份、8月份乳房炎病原菌监测情况

奶牛乳房炎病原菌感染因素主要包括以下几点[6～8]：不同乳区，年龄和胎次，产奶量和泌乳时间，季节和坏境因素，挤奶技术，饲养管理和遗传因素等。引起奶牛乳房炎的病原微生物达130多种，其中最常见的有20多种，包括细菌、霉菌、病毒和支原体等。根据来源和传播方式不同，通常分为传染性微生物和环境性微生物[9]。本试验监测的16种乳房炎致病菌中，葡萄球菌属、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌和支原体属属于传染性微生物，其危害比较大，感染后即使本身不发病，也会形成传染源[10]。这类微生物根植于乳腺，可通过挤奶工的手、清洁布、挤奶器械等传播。牛乳房链球菌、大肠杆菌和克雷伯氏菌属于环境性微生物，这类微生物广泛存在于奶牛体表皮肤及其周围环境中，在挤奶、挤奶间歇期和干奶期时，乳腺均可感染。

从本次监测结果可以看出，河北省7个市27个奶牛场的150份乳房炎牛奶样品中，传染性微生物的检出率最高，尤其是8月份的葡萄球菌属检出率高达100%；环境性微生物的检出率较高，尤其是8月份的大肠杆菌检出率达到64.28%。奶牛乳房炎致病菌检出率较高的牧场，在牧场卫生、挤奶操作、奶厅管理设备维护等方面存在较大问题。酵母菌检出率也比较高，可能是由于河北地区在6～8月中下旬处于雨季，长期不能放牧而导致棚台阴暗、潮湿，从而滋生酵母菌。

奶牛乳房炎通常是由两种或多种致病菌感染引起的，其防控关键在于切断传染源，控制感染，针对致病菌选择有效的治疗方案。同时，查找挤奶过程控制环节的不足，及时改进，规范奶牛场管理、操作程序，改善奶牛场卫生环境，也是有效降低乳房炎发病几率的重要措施。

[1] 肖定汉.奶牛病学[M]. 北京: 中国农业大学出版社, 2002.

[2] 李宏胜,郁杰,李新圃,等.奶牛乳房炎类型与病原菌感染之间相关性的研究[J]. 动物医学进展, 2004, 26(6):146-149.

[3] 袁永隆, 张礼华, 刘纯传,等.我国奶牛乳房炎常见病原菌的区系调查[J]. 中国农业科学, 1992, 25(4):70-76.

[4] 李宏胜,郁杰,李新圃,等.奶牛乳房炎类型与病原菌感染之间相关性的研究[J]. 动物医学进展, 2004, 25(6):80-84.

[5] 史冬艳,郝永清,张爱荣,等.奶牛金黄色葡萄球菌性乳房炎研究进展[J].动物医学进展, 2010,3(7):82-86.

[6] 马启才.奶牛隐性乳房炎的流行病学调查[J]. 畜牧与饲料科学,2009,10:168-169.

[7] 毛翔光, 毛华明, 朱新培.规模化奶牛场乳腺炎发病规律的调查分析[J]. 中国牛业科学,2009,35(5):66-69.

[8] 王玲,李宏盛,王正兵,等.规模化奶牛养殖区奶牛乳房炎的调查及病因分析[J]. 中国乳业,2010, 10:50-53.

[9] 余四九. 兽医产科学[M]. 北京:中国农业出版社, 2013.

[10] 许丹宁,侯振中,樊卫东. 奶牛隐性乳房炎的流行病学调查及病原菌的分离鉴定[J]. 现代畜牧兽医, 2015,9:40-41.

Analysis of Infection Situation of Pathogenic Bacteria Causing Dairy Cow Mastitis in Dairy Farms in Hebei Province in Summer

LIU Xin-ya1,2, LI Dan-yang1,2, ZHAO Li-mei1,2, LU Shi-yu1,2, LU Wen-cheng4, LIANG Chang-you5,
NI Jun-qing3, MA Ya-bin2,3
(1.Hebei Pinyuan Livestock Varieties Breeding Co.,Ltd, Shijiazhuang 050000; 2.Hebei Provincial Station for Quality Control of Livestock Varieties, Shijiazhuang 050061; 3.Hebei Provincial Station for Livestock Varieties Producing and Spreading, Shijiazhuang 050061; 4.Agricultural Bureau of Livstock and Aquatic Products of Zunhua, Zunhua 064200; 5.The People’s Government of Qianying Town in Fengnan of Tangshan City, Fengnan 053301)

A total of 27 dairy farms were randomly selected from 345 dairy farms which participated in DHI test in Hebei province. Then 50 cows with mastitis and signifcant clinical performance were selected, and the purifed bacterial DNA was amplified to the detection level for 16 pathogenic bacteria identification and quantification using real time PCR. Two monitoring results in June and August showed that, 16 major pathogens that caused cow mastitis were all positive, the highest detection rate was Staphylococcus, and the detection rate was 42.42%, 100%,respectively; followed by β-lactamase gene Staphylococci and yeast, the detection rate of which was 41.03%,92.85%, 33.33%, and 64.28%; both Corynebacterium and Serratia marcescens were negative in June and positive in August, but the detection rate was low. Clinical cow mastitis in summer is caused by mixed infection of two or more pathogens, Staphylococcus and β-lactamase gene Staphylococcus aureus showed the highest detection rate.

Dairy cows; Mastitis; Pathogens; Analysis

S858.23

A

1004-4264（2017）07-0043-03

10.19305/j.cnki.11-3009/s.2017.07.011

2017-01-26

农业部农业技术试验与示范——河北省奶牛生产性能测定补贴项目（项目编号：HBCT2013080206；HBCT2013080301）；奶牛精细化管理关键技术试验与示范项目（项目编号：冀农科15020）。

刘鑫雅（1992-），女，本科，现从事奶牛生产性能测定技术推广工作。

倪俊卿（1963-），女，研究员。