周文明 张 伟 申小平 刘 志 李世军 陆洪光



·论著·

CD163+肿瘤相关巨噬细胞在常见上皮性皮肤肿瘤中的分布

周文明1，2张 伟1申小平1刘 志1李世军1陆洪光1

目的： 检测CD163+肿瘤相关巨噬细胞在皮肤鳞状细胞癌、基底细胞癌、鲍温病、日光性角化病中的分布。方法： 采用免疫组织化学法(MaxVision法)检测CD163标记的肿瘤相关巨噬细胞在正常皮肤、鳞状细胞癌、基底细胞癌、鲍温病、日光性角化病中的分布。结果： 每高倍镜视野下正常皮肤、鲍温病、日光性角化病真皮浅层中CD163+巨噬细胞个数为(9.5000±1.71594)、(43.9200±9.98716)和(49.4000±8.73830)个;基底细胞癌肿瘤间质中为(42.1724 1±11.73234)，鳞状细胞癌的肿瘤间质中及肿瘤实质内为(65.8421±14.05649)。结论： CD163+肿瘤相关巨噬细胞可能与皮肤上皮性肿瘤的发生、发展相关。

肿瘤相关巨噬细胞； 皮肤鳞状细胞癌； 基底细胞癌； 鲍温病； 日光性角化病； CD163

鳞状细胞癌、基底细胞癌、鲍温病、日光性角化病是皮肤常见的肿瘤，随着人类寿命的延长及生活方式的改变，环境污染的加重，上述肿瘤发病率有增加的趋势，目前一些研究表明这些肿瘤的发生与紫外线、长期慢性刺激等原因引起的细胞自身DNA突变有关。Scott等研究表明肿瘤的发生除基因突变因素外，还与由大量淋巴细胞、血管、淋巴管、纤维细胞、巨噬细胞、细胞外基质等在肿瘤细胞周围组成的肿瘤微环境相关[1]。其中存在于肿瘤实体及其周围组织中的巨噬细胞称为肿瘤相关巨噬细胞(tumor associated macrophages, TAM)，主要是M2型巨噬细胞，常伴随实体肿瘤存在于肿瘤细胞周围及其间质组织中。CDl63是编码在12p13.3上的跨膜蛋白，并仅限于单核细胞和巨噬细胞谱系，以往研究认为是M2型肿瘤相关巨噬细胞特异性较高的一个标志物[2,3],能促进肿瘤的进展。因此，我们试图通过免疫组化标记观察CD163+肿瘤相关巨噬细胞在皮肤常见上皮性肿瘤中的分布情况，并比较不同皮肤肿瘤间分布的差异性，探讨CD163+肿瘤相关巨噬细胞在皮肤上皮性肿瘤发生、发展过程中作用及意义。

1 资料与方法

1.1 资料收集 本研究收集贵州医科大学附属医院皮肤科2008-2016年经组织病理学证实的皮肤上皮性肿瘤病变的活检存档蜡块，鳞状细胞癌19例,男9例、女10例，曝光部位15例、非曝光部位4例，最大年龄88岁、最小年龄17岁，平均71.35岁；鲍温病25例，男15例、女10例，最大年龄84岁、最小年龄50岁，平均66.77岁，均位于非曝光部位；日光性角化病20例，男6例，女14例，最小年龄25岁(继发于着色性干皮病)，最大年龄87岁，平均71.38岁；基底细胞癌29例，男12例、女17例，曝光部位27例、非曝光部位2例，最大年龄82岁、最小年龄33岁，平均61.89岁；10例正常皮肤来源于整形外科整形术后遗弃的皮肤，所有标本经10%的中性福尔马林溶液固定，常规石蜡包埋，所有HE切片均由两位病理医生阅片。

1.2 主要试剂 即用型鼠抗人单克隆抗体CD163、即用型快速免疫MaxVisionTM检测试剂盒及DAB显色剂均购自福州迈新生物技术有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 常规石蜡包埋，4 μm切片,防脱多聚赖氨酸玻片捞片，60℃烘考2 h，于4℃保存备用。

1.3.2 免疫组织化学(MaxVision)阳性对照由福州迈新生物技术有限公司提供，阴性对照用PBS代替一抗。石蜡切片脱蜡，水化，柠檬酸高压修复抗原，按试剂盒说明书进行操作，DAB显色，苏木素复染，二甲苯透明，中性树胶封片，光镜观察。

1.4 结果判定 CD163定位于的胞膜或胞质，阳性表现为细胞质或细胞膜棕黄色颗粒沉积，CD163阳性细胞即M2型TAM，首先低倍镜(×100)观察切片TAM密集区域，然后随机选取5个高倍镜视野(×400)，计数阳性细胞的数量，取平均值，相隔15天后再次用上述方法计数阳性细胞数量，两次结果的平均值纳入最后统计。

2 结果

2.1 每高倍镜视野下(×400)，正常皮肤真皮浅层中仅见少量CD163+TAM，数量为(9.5000±1.71594)个；鲍温病、日光性角化病的真皮浅层见大量的CD163+TAM，数量分别为(43.9200±9.98716)个、(49.4000±8.73830)个;基底细胞癌的肿瘤间质中见大量的CD163+TAM浸润，数量为(42.1724±11.73234)个、鳞状细胞癌的肿瘤间质中及肿瘤实质内见大量的CD163+TAM浸润，数量为(65.8421±14.05649)个(图1)。

2.2 在鳞状细胞癌的肿瘤实质中易见CD163+TAM，在鲍温病、日光性角化病、基底细胞癌的肿瘤实质中几乎未见CD163+TAM(图1)。

2.3 CD163+TAM在皮肤肿瘤组织中均有较多浸润，与正常皮肤相比，差异有统计学意义(P<0.05)；鲍温病、日光性角化病、基底细胞癌中CD163+TAM的分布差异无统计学意义(P>0.05)；鲍温病、日光性角化、基底细胞癌与皮肤鳞状细胞癌中的CD163+TAM比较，差异有统计学意义(P<0.05)(表1)。

表1 正常对照组及皮肤上皮性肿瘤组织中CD163+TAM两两比较

注：正常对照组 (N);鲍温病(BD);日光性角化病(AK);基底细胞癌(BCC);鳞状细胞癌(SCC)

3 讨论

肿瘤相关巨噬细胞来源于骨髓中的造血祖细胞，进入血液循环后变成单核细胞，进而迁移至肿瘤组织中分化而成。TAM具有高度的异质性和可塑性，在不同的微环境中可活化形成不同的表型，巨噬细胞根据环境不同大致可极化为经典活化型巨噬细胞(M1型)及替代活化型巨噬细胞(M2型),M1型巨噬细胞主要由肿瘤坏死因子TNF-α，干扰素IFN-γ 所诱导分化，具有很强的呈提抗原能力， 通过分泌产生白细胞介素 IL-12，IL-23等其他活性氧化物， 从而能够杀灭微生物和发挥抗肿瘤作用。M2型巨噬细胞是由IL-4、IL-10、IL-13、CSF-1 诱导分化，促进肿瘤的生长与转移[4]。Schmieder等[3]研究指出，在肿瘤发病的开始阶段招募到肿瘤部位的单核细胞接受促炎症信号分化成M1型巨噬细胞，随后M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞即TAM转化，促进肿瘤的进一步发展。由于巨噬细胞膜表面趋化因子受体存在差异性表达，肿瘤组织能够通过分泌趋化因子选择性的募集M2型极化的TAM，从而使之参与免疫抑制性肿瘤微环境的形成[5]。Van Overmeire等[6]研究认为，组织氧含量低，TAM表达上调，而侵袭性强的肿瘤细胞生长迅速，肿瘤组织内及其周围形成低氧环境，利于TAM的聚集。大量研究表明肿瘤组织中M2型肿瘤相关巨噬细胞浸润明显增多，M2型巨噬细胞通过分泌组织基质金属蛋白酶促进基质重塑，破坏基底膜，通过分泌释放促血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor VEGF)、转化生长因子β(transforming growth factor B，TGF-β)促进血管、淋巴管的生成和参与机体的免疫抑制反应，以适应及促进肿瘤细胞的生长，并为肿瘤细胞迁移、浸润和转移开辟了道路,发挥促癌作用[7-10]。此外有报道，在肺癌、乳腺癌、甲状腺癌、前列腺癌、黑素瘤、淋巴瘤等肿瘤中TAM高表达，患者往往生存率低，死亡率高、预后差[11-14，3，8],但在结肠癌肿瘤中 TAM高表达，患者生存率高，预后好[15]。Lundholm等研究认为肿瘤相关巨噬细胞在前列腺癌与结肠癌中浸润增加表现出两种截然不同的预后，这主要是因为在结肠癌中有大量的Th1细胞及细胞毒性T细胞，而前列腺癌中主要是未活化的初始T细胞[14]。殷芳等分别用M1、M2型巨噬细胞与黑素细胞株A375培养，M2型巨噬细胞促进A375细胞的增殖、侵袭和迁移，M1型巨噬细胞抑制A375细胞的增殖、侵袭和迁移[15]，表明M2型巨噬细胞是肿瘤恶性生物学行为的“助推器”。

①正常对照组真皮浅层；②鲍温病真皮浅层；③日光性角化真皮浅层；④基底细胞癌肿瘤间质；⑤鳞状细胞癌肿瘤间质；⑥鳞状细胞癌肿瘤实质

图1 CD163+TAM在不同皮肤组织中的分布(IHC,×400)

国内鲜有报道皮肤常见上皮性肿瘤与TAM的关系的研究，大部分肿瘤的发生、发展需经过癌前病变、原位癌、最后发展为浸润癌，是一个多因素、多阶段、逐渐的演变过程，日光性角化病、鲍温病、鳞状细胞癌属于鳞状上皮来源的不同发展阶段肿瘤，且我们已知鳞状细胞癌比基底细胞癌具有更加恶性的生物学行为，对于我们研究CD163+TAM在皮肤常见上皮性肿瘤中的发生发展中的作用更为有利。我们的研究表明，鲍温病、日光性角化病的真皮浅层及基底细胞癌、鳞状细胞癌的肿瘤间质中见大量的CD163+TAM浸润，提示在肿瘤细胞分泌的细胞因子及高代谢情况下造成肿瘤组织周围缺氧等因素促进了CD163+TAM募集；在鳞状细胞癌的肿瘤实质中易见CD163+TAM，在鲍温病、日光性角化病、基底细胞癌的肿瘤实质中几乎未见CD163+TAM，提示可能为基底膜及在HE染色下基底细胞癌肿瘤实质周围的收缩间隙作为一个屏障阻止CD163+TAM的渗入，同时也阻止了肿瘤细胞进入周围间质，使得肿瘤细胞无法通过间质血管及淋巴管实现远处器官转移，这可能是基底细胞癌罕见远处转移的原因之一，同时提示皮肤上皮性肿瘤中瘤巢实质内存在CD163+TAM与肿瘤的恶性潜能相关可能。鲍温病、日光性角化病、基底细胞癌中的CD163+TAM分布差异无统计学意义，与其三种肿瘤均为局部病变相一致，而其三种局部病变中CD163+TAM的密度与鳞状细胞癌相比均明显低于鳞状细胞癌，差异有统计学意义，表明在皮肤上皮性常见肿瘤中CD163+TAM的密度随着肿瘤生物学行为恶性潜能的增加上调。我们推测，一方面，肿瘤细胞分泌的细胞因子及迅速生长造成的低氧环境促进了巨噬细胞向CD163+TAM分化及募集在肿瘤周围，另一方面，CD163+TAM细胞分泌的细胞因子促进新血管和淋巴管生成，破坏基底膜，肿瘤周围组织重塑，以适应及促进肿瘤细胞的生长，并为肿瘤细胞迁移、浸润和转移创造条件，肿瘤细胞与CD163+TAM两者相辅相成，形成一种共生的环境。Kakizaki等[16]在皮肤原发性CD30+淋巴细胞增殖性病变中淋巴瘤样丘疹病与皮肤原发性CD30+大细胞间变性淋巴瘤中CD163+TAM的构成比较研究与我们的研究相一致，表明随着肿瘤的进展，CD163+TAM逐渐增多。

巨噬细胞在不同的细胞因子作用下实现M1型向M2型或M2型向M1型巨噬细胞的转化，从而对肿瘤因子作用起促进或抑制的不同作用。

而Pettersen等[17]研究皮肤鳞癌患者癌组织时发现，巨噬细胞发生多种极化， 其中有M1型、M2型，还存在一类同时表达M1和M2型的亚型。我们的数据表明鳞状细胞癌组织中炎细胞绝大多数是CD163阳性，提示该肿瘤组织中主要是M2型或同时表达M1和M2型的亚型。Tjiu等的研究表明在基底细胞癌中，环氧化酶2诱导肿瘤相关巨噬细胞的增多促进肿瘤细胞的侵袭及血管生长[18]。Li研究发现鳞状细胞癌细胞与巨噬细胞共培养将诱导巨噬细胞产生肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)α诱导蛋白8家族样蛋白2(TNF-α induced protein8like2, TNFAIP8L2, TIPE2)，消耗TIPE2后巨噬细胞与鳞状细胞癌细胞共培养后M2表型减少，而鳞状细胞癌组织中发现在巨噬细胞中高表达TIPE2的患者的总的5年生存率明显降低，因此认为TIPE2在肿瘤相关巨噬细胞和皮肤鳞状细胞癌之间起一个桥梁作用[19]，综上所述，M2型肿瘤相关巨噬细胞促进了皮肤常见上皮性肿瘤的发生及发展，因此可以将CD163+肿瘤相关巨噬细胞作为肿瘤分子治疗的一个靶点，特别是对无法外科手术切除、术后影响美观及侵袭性转移性的病变具有一定的意义。

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(收稿：2017-01-15 修回：2017-03-11)

Detect of CD163+tumor associated macrophages in common skin epithelial tumors

ZHOUWenming1，2,ZHANGWei1,SHENXiaoping1,LIUZhi1,LIShijun1,LUHongguang1.

1.DepartmentofDermatology,AffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China; 2.People'sHospitalofTongren,Guizhou,Tongren554300,China

Correspondingauthor:LUHongguang,E-mail：hongguanglu@hotmail.com

Objective: To detect the distribution of CD163+tumor associated macrophage in skin squamous cell carcinoma, basal cell carcinoma, Bowen's disease and actinic keratosis. Methods: The distribution of CD163+tumor associated macrophages under in the normal skin,skin squamous cell carcinoma, basal cell carcinoma, Bowen's disease and actinic keratosis were detected by the immunohistochemitry method (MaxVision). Results: The number of CD163+tumor associated macrophage in the upper dermis of the normal skin, Bowen's disease and actinic keratosis were (9.5000±1.71594), (43.9200±9.98716) and (49.4000±8.73830) respectively and 42.17241±11.73234 in the tumor stroma of basal cell carcinoma, 65.8421±14.05649 in the tumor stroma and parenchyma of the skin squamous cell carcinoma. Conclusion: The CD163+tumor associated macrophages may play an important role in the occurrence and development of the common skin epithelial tumors.

tumor associated macrophage; skin squamous cell carcinoma; basal cell carcinoma; Bowen's disease; actinic keratosis; CD163

贵州医科大学学科建设经费资助(编号：0215025100104)

1贵州医科大学附属医院皮肤科，贵州贵阳,550004 2贵州省铜仁市人民医院，贵州铜仁,554300

陆洪光，E-mail：hongguanglu@hotmail.com