孟紫薇 崇晓霞（通讯作者）

（内蒙古医科大学附属医院眼科，内蒙古呼和浩特010030）

微球法检测干眼患者泪液中IFN-γ与IL-17细胞因子浓度的相关分析

孟紫薇 崇晓霞（通讯作者）

（内蒙古医科大学附属医院眼科，内蒙古呼和浩特010030）

目的通过微球法（Cytometric bead array，CBA），即微量样本多重蛋白定量技术测定干眼患者与正常对照组泪液中的两种细胞因子IFN-γ（Interferon-γ）与IL-17（Interleukin-17）的浓度，探讨炎症因素在干眼的发病机制中的作用。分析各组泪液中IFN-γ与IL-17两种细胞因子的浓度与临床检查结果的相关性。方法本研究为2015年至2016年内蒙古医科大学附属医院眼科门诊就诊的患者，进行包括视力、泪膜破裂时间（Break up time，BUT）、泪液分泌实验I（Schirmer I test，SⅠt），依据日本干眼标准（2005）筛选功能性干眼患者21例（21眼：14例右眼，7例左眼），其中男4人（4眼：2例左眼，2例右眼），女17人（17眼：12例右眼，5例左眼），眼别筛选依据患者自觉症状较为严重的一侧。依据正常对照组标准筛选健康志愿者18例（18眼：11例右眼，7例左眼），其中男4人（4眼：2例左眼，2例右眼），女14人（14眼：9例右眼，5例左眼），眼别选取与病例组性别相匹配（两组间每侧眼男女比例接近1：1）。使用毛细管法收集上述两组泪液。通过CBA法检测泪液样品中IFN-γ与IL-17的浓度，并与临床检查结果进行相关分析。结果正常组与对照组的年龄、性别无统计学差异（P=0.558）。两组被检者SⅠt有统计学差异（P＜0.001）；两组泪液样本中IL-17浓度与SⅠt有统计学意义（r=0.38，P=0.001）；被检者SⅠt结果与BUT结果相关性有统计学意义（P＜0.001）。结论①两组被检者泪液中的细胞因子浓度并未发现有统计学差异，但病例组IFN-γ浓度中位数较对照组高。②两组被检者SⅠt结果与BUT结果有统计学差异，说明传统方法检测仍是不可代替的检查方法。且SⅠt与BUT是评估干眼的敏感指标。③被检者IL-17浓度与SⅠt结果存在正相关性，推断IL-17浓度的增加对泪液的减少分泌是一种保护性因素。

干眼；CBA法；IFN-γ；白细胞介素

干眼是常见眼病，是由于泪液的质或量或流体动力学异常引起的泪膜不稳定和（或）眼表损害，从而导致眼不适症状及视功能障碍的一类疾病[1]。发病率逐年增高，临床症状多样，症状与临床检查结果的一致性差。有研究表明泪膜渗透压的升高和炎症原因都是导致干眼的重要因素[2]，研究泪液中的炎性因子的变化，能够发现炎症因素与干眼相关性。关于泪液中的蛋白质国外Zhou等[3]曾报道了正常人泪液中包含1500多种蛋白。在泪液中占20%左右的四种主要蛋白分别是溶菌酶、乳铁蛋白、分泌型免疫球蛋白（Secretory immunoglobulin A，SIgA）以及载脂蛋白lipocalin。干眼中致病的免疫细胞中不断活化的主要是CD4+T细胞，Th17作为一种CD4+T细胞，特异性分泌IL-17家族细胞因子[4]，IL-17主要是指IL-17A，辅助性T细胞-17（T helper cell，Th17）是2005年研究自身免疫疾病时发现的新型Th亚群，Th17可以产生多种细胞因子，包括IL-17、IL-21等，Th17以及它所产生的细胞因子能够介导炎症反应从而成为疾病的重要发病环节[5]，并且Th17细胞抑制作用的丧失可能会导致干眼。Th17细胞参与发病机制在于眼表干燥环境导致Th17细胞诱导因子，如IL-6、转化生长因子-β、IL-23等增强表达，通过信号传导促进Th17细胞分化分泌效应IL-17。IL-17还参与了中性粒细胞的增生、成熟和趋化并能够促进树突状细胞的成熟[6]，IL-17与受体结合，分泌基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases，MMPs）和炎性因子，导致眼表上皮损伤，加重干眼病情。Li等[7]认为IL-12、IL-1β、IL-6、IFN-γ和TNF-α等细胞因子均诱导小的富含脯氨酸蛋白1B（SPRR1B），而SPRR1B是眼表上皮鳞状化生的标志。原有研究发现干燥综合症患者的泪腺及涎腺中存在IFN-γ的高表达[8]。干扰素IFN可分为两型，IFN-α与IFN-β属于I型干扰素，主要的功能是消除病毒。IFN-γ属于II型干扰素，主要功能是介导和调节特异性免疫[9]。并且有研究[10-11]证实过Th1型细胞与IL-17之间存在相互调节，IL-17可以与IFN-γ共同作用，并且放大其致炎作用。

由于干眼患者泪液较少，所以采用Cytometricbead array（CBA）即微量样本多重蛋白定量技术，这是一个基于流式细胞检测系统的多重蛋白定量测定方法，这种方法灵敏度高，而且可以同时检测多种蛋白，能够解决样本量较少的问题。它利用不同的捕获微球包被有特异性的捕获抗体，与待测样品带有的自身抗原结合后，加入检测抗体，孵育形成“三明治”复合物，检测抗体带有不同的荧光强度，通过流式细胞仪可分析结果。

1 材料与方法

1.1 研究对象：选取2015至2016年内蒙古医科大学附属医院眼科门诊就诊的患者进行筛查。干眼组：按照纳入标准确定功能性干眼患者21例，其中男4人，女17人。及健康志愿者18人，其中男4人，女14人，眼别选取与病例组性别相匹配。所有研究对象都要进行基础眼部检查包括视力检查、眼压、裂隙灯检查、直接眼底镜检查、SⅠt以及BUT检查。所有相关检查均取得患者同意后进行。

1.2 检查以及收集方法

1.2.1 SⅠt基础泪液分泌实验：将测试泪液专用滤纸一端使用无菌镊反折5 mm，轻轻置于患者下睑结膜囊中外1/3处，另一端自然下垂，嘱受检者轻轻闭眼，5 min后观察滤纸被泪液湿润的长度。

1.2.2 BUT检查：使用Tomy全自动角膜地形图仪准确测量BUT时间。调整机器使用BUT模式，嘱患者正常瞬目两次后，使用角膜地形图仪测量被检者泪膜破裂时间，三次取平均值。

1.2.3 毛细管法收集研究对象泪液：在受试者瞬目数次后用40 μL毛细管于患者外眦部收集泪液，在不刺激到患者的情况下收集泪液约5 μL，迅速送往-80℃冰箱保存样本，待使用。

1.2.4 角膜荧光素染色：评分方法规定，无染色为0分，将角膜平均分为四个象限，每个象限又分为轻、中、重度三级，共为0～12分，规定＜1分为正常。

2 结果

2.1 年龄性别对比：病例组与正常对照组在年龄（P=0.67）、性别（P=1.00）分布上无统计学差异。

2.2 临床检查结果比较：病例组IL-17A浓度为（3279.80±1584.21）fg/mL，正常组浓度为（4086.46± 1980.14）fg/mL。病例组IFN-γ浓度中位数为3362.37（1493.62～5732.51）fg/mL，正常对照组浓度中位数为3975.20（2552.63～13334.25）fg/mL，两组IFN-γ和IL-17比较无统计学差异。干眼组患者BUT平均值为（2.18±2.18）s，正常组患者的BUT为（4.85±2.40）s。SⅠt正常组为（18.00±5.86）mm，干眼组为（10.00±7.88）mm。两组被检者BUT和SⅠt存在统计学差异（P＜0.001），详见表1。

表1 干眼组与正常对照组临床检查结果

2.3 相关性分析：泪液样本中IL-17浓度与SⅠt存在相关性（P=0.001），泪液样本中IL-17浓度与BUT结果没有相关性（P=0.25），IFN-γ浓度BUT结果无相关性（P=0.31）。IFN-γ浓度与临床检查SⅠt结果没有相关性（P=0.484），SⅠt结果与BUT结果存在相关性（P＜0.01），详见图1和图2。

2.4 男女性别IFN-γ和IL-17比较：正常组中男性与女性泪液中IFN-γ（P=0.40）与IL-17（P=0.43）浓度均无统计学差异，干眼组患者男性与女性泪液中IFN-γ（P=0.53）与IL-17（P=0.38）浓度无统计学差异。

图1 受检者泪液中IL-17浓度与SⅠt相关性分析

图2 受检者BUT检查及SⅠt检查结果相关性分析

3 讨论

1996年美国国立眼科研究所干眼研究组将角结膜干燥症与干眼症作为同一概念，称为干眼[12]。所以干眼包括了泪膜不稳定，泪液缺乏引起的干燥，还包括眼表上皮病理改变发生的干燥症状。本研究虽然在所有的样本中均检测出IFN-γ与IL-17A两种泪液蛋白的浓度，但是并未发现干眼组和正常对照组两种蛋白浓度存在有统计学意义的差异。所以本研究中泪液IL-17A与IFN-γ两种细胞因子的浓度并不能成为判断炎症因素参与干眼发病的指标，但病例组IFN-γ浓度中位数较对照组高，能够提示病例组泪液中的IFN-γ浓度与正常对照组有一定差异。本实验中两组泪液中IL-17A浓度并未发现差异，但SⅠt结果与泪液样本中IL-17A浓度呈正相关。泪液分泌的量与IL-17A浓度存在正相关性，说明被检者泪液的分泌量与细胞因子的浓度有关，病例组的泪液分泌量明显少于对照组，但两者的IL-17A浓度并没有差异，由此推断被检者IL-17浓度与SⅠt结果存在正相关性，可能IL-17浓度的增加对泪液的减少分泌是一种保护性因素。两组患者SⅠt结果BUT结果统计学上均有显著性差异，说明两组患者在泪液的质和量都存在明显差异。

本实验过程中存在诸多不足，实验没有统一收集泪液的时间，并不能确定上午下午被检者泪液中蛋白含量是否一致。而且针对患者的主诉并未使用调查表记分制和角膜荧光素染色记分制来评估，未能发现临床症状的特异性与泪液中炎性因子的相关性，因此可能对本研究结果造成一定的影响。进一步的研究中，应该结合干眼患者症状体征评分表，能够更加明确患者的临床症状与检查的相关性。并且在一天内的不同时间收集患者泪液可以获得泪液中细胞因子的变化规律，还应该对比治疗后的同一批患者泪液，以观察细胞因子的变化，分析泪液中的致炎因子与疾病发病与转归的关系。

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［4］Langrish CL，Chen Y，Blumenschein WM，et al.IL-23 drives a pathogenic T cell population that induces autoimmune inflammation［J］.Journal of Experimental Medicine，2005，201（2）：233-240.

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Analysis of IFN-Gamma and IL-17 Vytokine Determination in Dry Eye Tears by Cytometric Bead Assay

Meng Ziwei Chong Xiaoxia
（Department of Ophtalmology，Inner Mongolia Medical University Affiliated Hospital，010030，China）

ObjectiveThe concentrations of two cytokines IFN-γ（Interferon-γ）and IL-17（INTERLEUKIN-17）in tear in dry eyes and normal control group were measured by Microsphere method（Cytometric Bead Array，CBA，which is a micro-sample multiple protein quantification technique），and the role of inflammatory factors in the pathogenesis of dry eye was investigated.2.Analysis of the correlation between the concentrations of IFN-γ and IL-17 two cytokines in tear and the Clinical examination results：MethodsFor the 2015-2016，Inner Mongolia Medical University affiliated hospital ophthalmic outpatient clinic patients，including vision，tear film rupture time（break up Time，BUT），tear secretion experiment I（Schirmer i test，SⅠt），According to Japan Dry Eye Standard（2005）screening functional Dry eye patients 21 cases（21 eyes；14 cases of the right eye，7 cases left eye，the male 4（4 eyes，2 case left eye，2 case right eye）female 17（17 eyes；12 cases right eye，5 case left eye），eye screening according to patient conscious symptom more serious side.Screening healthy volunteers in 18 cases（18 eyes，11 right eyes，7 left eyes）According to the normal control group.Among the men 4（4 eyes，2 cases left eye，2 case right eye）female 14（14 eyes，9 cases of right eye，5 case left eye），eye selection and case Group Sex match（two group between men and women in each side of the proportion of close to 1：1）. The two groups of objects were collected by capillary method.The concentration of IFN-γ and IL-17 in tear samples was detected by CBA method，and the correlation was correlated with clinical examination results.ResultsThere was no statistically difference between the age and sex of the normal group and the control group（P=0.558）.There were statistically significant differences between the two groups of SⅠt（P＜0.001）；the correlation between IL-17 concentrations and S-t results in two groups of tear samples was statistically significant（r=0.38，P=0.001）；the correlation of SⅠt results with BUT results was statistically significant（P＜0.001）. ConclusionThe concentrations of cytokines in tear in two groups were not found statistically significant，but the median number of IFN-γ concentrations in the case group was higher than that of the control group.There are significant differences in statistics between s t and BUT results in two groups，indicating that the traditional method detection is still irreplaceable.And the SⅠt and BUT are sensitive indices for evaluating dry eyes.The IL-17 concentration of the detector and the SⅠt results are positively correlated，and the increase of IL-17 concentration is a protective factor in reducing tear secretion.

Dry eye；Cytometric bead assay；IFN-gamma；Interleukin-17

R777.34

A学科分类代码：32037

1001-8131（2017）03-0230-03

2017-03-15