廖昂+邓启明+董林玲+余燕飞+刁奇志+丁强

[摘要] 目的 研制基于石墨烯/多壁碳納米管检测风疹病毒IgM抗体（RV-IgM）的电化学传感器，并对其分析性能进行评价。 方法 将风疹抗原固定于经氧化态石墨烯（GS）、壳聚糖（CHI）、多壁碳纳米管（MWCNT）、1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐（[BMIM][PF6]-NH2）、金纳米离子、硫堇纳米材料等生物材料层层修饰的丝网印刷电极表面，并用辣根过氧化物酶进行封闭制得研究所用的电化学传感器。使用循环伏安法对层层修饰后的传感器电极进行测试，并对传感器进行优化实验，确定传感器的最佳实验条件。在最佳实验室条件下，对传感器的分析性能进行评价。 结果 裸电极经多种生物材料层层组装后，电极峰电流逐渐增大；包被抗原及辣根过氧化物酶后，电极响应电流减弱。传感器的最佳pH值及H2O2浓度分别为7.0和8.0 mmol/L，最佳孵育温度及时间分别为35.0℃和30 min。传感器检测RV-IgM的重复性精密度及日间精密度分别为3.4%、4.9%；线性范围为0.1～300 pg/mL，检出限为40 fg/mL；回收率为97.5%，抗干扰性强。 结论 在最佳实验条件下，组装电化学传感器与目前现有的检测风疹病毒方法比较，具有灵敏度高、精密度和正确度较好、且快速简便、可定量的优点。

[关键词] 石墨烯/多壁碳纳米管；电化学传感器；风疹病毒；IgM抗体

[中图分类号] R511.203 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）05（b）-0177-04

[Abstract] Objective To develop a electrochemical sensor based on multiwalled carbon nanotube-graphene for detection of the rubella virus IgM antibody and to evaluate its analytical performance. Methods Oxidized graphene （GS）， chitosan （CHI）， multi-wall carbon nano-tubes （MWCNT）， 1-butyl-3-methylimidazolium hexafluorophosphate （six-[BMIM][PF6]-NH2）， gold nanoparticles and thionine biological nanomaterial were used as materials to modify screen printing electrode by layer-by-layer self-assembly and then rubella antigen was immobilized on the assembled electrode surface， afterwards coated by horseradish peroxidase and eventually formed the electrochemical sensor used in this study. The layer-by-layer assembled electrode was scanned by cyclic voltammetry to detect its electrochemical performance. The optimum experimental conditions of the sensor were obtained by optimization experiments. The analytical performance of the sensor was evaluated under the optimum experimental conditions. Results After the bare electrode was assembled with above-mentioned materials， the peak current and conductivity of the electrode gradually increased， and the response current gradually decreased after being coated by antigen and horseradish peroxidase. The optimum pH value and H2O2 concentration were 7.0 and 8.0 mmol/L respectively. The optimum incubation temperature and time were 35.0℃ and 30 minutes respectively. The repeatability precision and inter-day precision of the detection of rubella virus IgM antibody were 3.4% and 4.9% respectively， the linear range was 0.1-300 pg/mL， the detection limit was 40 fg/mL， the recovery rate was 97.5%. And at the same time， the sensor had a good anti-interference performance. Conclusion Under the optimum experimental conditions， the assembled electrochemical sensor for detection of rubella virus has the advantages of higher sensitivity， better precision and accuracy， the rapid and simple operation and also quantifiability compared with the existing methods.

[Key words] Multiwalled carbon nanotube/grapheme； Electrochemical sensor； Rubella virus； IgM antibody

妇女妊娠期间，由于内分泌及免疫状态的改变，感染风疹病毒风险也相应增加，从而引起流产或胎儿畸形，甚至死胎[1]。虽然风疹病毒疫苗的普及对预防其感染起到了重要作用，但体内抗体会随着时间延长而逐渐降低。目前我国每年仍约有4万名新生儿患先天性风疹综合征。目前，检测风疹病毒的实验室方法主要为酶联免疫吸附测定（ELISA）法和化学发光法，但这两种方法均存在灵敏度较低、检测时间较长且不能实时检测的缺点。近年来电化学免疫传感器因其高灵敏度、高特异性、可定量等优点逐步应用于疾病的诊断，检测病毒抗原的检测限可达到30 pg/mL[2]，因此研制用于检测风疹病毒IgM抗体（RV-IgM）的电化学免疫传感器可弥补目前实验方法的不足。

1 仪器与材料

1.1 仪器

电化学工作站购自上海辰华公司，H-7500透射电子显微镜为日本日立公司生产，一次性丝网印刷电极购自台湾ZensorR&D公司。

1.2 材料

多壁碳纳米管（MWCNT）（批号20131123）购自成都有机化学品有限公司；石墨烯（批号20140315）购自先丰纳米科技有限公司；1-丁基-3甲基-6氟磷酸盐购自上海晨杰化学品有限公司；壳聚糖（CHI）、辣根过氧化物酶、过氧乙酸购自上海生工生物科技有限公司；硫堇、氯金酸（批号20150308）购自美国Sigma公司。风疹抗原（批号20151103）购自美国Meridian公司，风疹IgM标准品（批号20151016）购自NIBSC。所有试剂均为分析纯等级。

2 方法与结果

2.1 方法

2.1.1 电化学免疫传感器的制备

根据文献[3-5]制备离子液体-石墨烯（GS-[BMIM][PF6]），将GS-[BMIM][PF6]与生物保护剂CHI、MWC-NT混合，得到MWCNT-CHI-GS-[BMIM][PF6]纳米复合材料，取该混合物滴加在丝网印刷电极中的工作电极表面，自然干燥1 d。随后将金纳米离子及硫堇先后滴在MWCNT-CHI-GS-[BMIM][PF6]修饰的丝网印刷电极表面，37℃自然干燥1 d，如此反復3次。最后在电极表面滴加8 ng的风疹抗原包被液，自然风干过夜，用蒸馏水进行冲洗，去除未固定的抗原，滴加5 μL 0.25% HRP溶液进行封闭，放置4℃冰箱保存备用。

2.1.2 传感器的性能检测

分别对石墨烯及纳米金进行透射电镜扫描。对层层修饰后的电极在含有0.1 mol/L氯化钾的5 mmol/L Fe（CN）63-/4-溶液中使用循环伏安法从0.1～0.7 V进行扫描（扫描速度为0.05 V/s），得到不同的循环伏安图。

2.1.3 实验条件的优化

分别在不同的pH值溶液、不同浓度的H2O2溶液中对传感器电极的响应电流进行检测，响应电流最大，峰值电流的增幅最大时的pH值及H2O2浓度为最佳，以及在不同的孵育温度、孵育时间，电极响应电流最低的孵育温度及时间为最佳。

2.1.4 电化学免疫传感器的分析性能测试

在以上实验所得最佳实验条件下对组装的电化学传感器进行性能测试。

2.1.4.1 标准曲线的制作及检测限的检测 使用研制的电化学传感器，在最佳实验条件下对不同浓度的RV-IgM标准品进行检测，对所得实验数据作线性回归分析。同样条件下对空白实验液进行检测，重复3次，计算出检测限。

2.1.4.2 精密度测试 一天之内检测浓度为100 U/mL RV-IgM 3次，连续检测5 d，分别计算批内及批间精密度。

2.1.4.3 准确度验证 取0.1 mL浓度为100 U/mL的RV-IgM标准品作为回收实验管及不含RV-IgM的生理盐水作为空白管，使用研制的传感器分别对实验管及空白管连续检测3次，取均值作为回收实验浓度及本底浓度，标准品浓度作为标准浓度，计算回收率，回收率=回收浓度/标准浓度×100%。

2.1.4.4 干扰实验 分别将0.1 mL浓度为10 μg/mL的单纯孢疹病毒IgG、类风湿因子和人乳头状瘤病毒IgG作为干扰物加入0.9 mL浓度为100 U/mL RV-IgM溶液中，作为实验管，不含干扰物的同浓度的RV-IgM溶液作为对照管，进行测量。

2.1.5 统计学方法

使用SPPS 19.0统计软件对上述数据进行统计分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，将干扰实验的含干扰物质的实验管测量结果分别与对照管测量结果进行配对t检验，P < 0.05，则干扰可接受。

2.2 结果

2.2.1 电镜扫描结果

MWCNT-GS-Chit-[BMIM][PF6]纳米复合材料经透射电子显微镜扫描结果见图1。

2.2.2 传感器的性能检测结果

纳米材料经层层修饰电极后，以0.05 V/s扫描速度对电极进行扫描，得到的循环伏安图见图2，可见随着修饰材料的增加，电极电流逐渐增强。

2.2.3 实验条件的优化

对实验反应体系的最佳pH值、H2O2浓度、抗体的孵育时间及温度的选择进行优化实验得出：最佳pH值为7.0，最佳H2O2浓度为8.0 mmol/L，最佳孵育温度为35.0℃，最佳孵育时间为30 min。见图3～6。

2.2.4 电化学免疫传感器的分析性能测试结果

2.2.4.1 标准曲线及检测限 回归方程为Y = 0.2776X+5.4813，相关系数为0.98，线性范围为0.1～300 pg/mL，检测限为40 fg/mL。见图7。

2.2.4.2 电化学免疫传感器精密度测量结果 计算得出重复性精密度、批间精密度、日间精密度分别为3.4%、4.1%、4.9%。

2.2.4.3 电化学免疫传感器正确度测量结果 回收实验浓度及本底浓度均值分别为97.8、0.03 U/mL，由此計算的回收浓度（回收实验浓度-本底浓度）及回收率分别为97.5 U/mL及97.5%。

2.2.4.4 抗干扰实验结果 对照管浓度为（89.96±3.52）U/mL，含单纯孢疹病毒IgG、类风湿因子和人乳头状瘤病毒IgG干扰物质的实验管浓度分别为（90.52±3.51）、（89.87±3.12）、（90.78±3.76）U/mL，对照管浓度与以上实验管浓度比较差异无统计学意义（均P > 0.05）。

3 讨论

CHI含大量羟基和氨基，对生物大分子及有机小分子具有较强的吸附能力，且具有良好的生物相容性、渗透性及成膜性，但导电性能较差，而石墨烯是目前已知最薄的二维材料，与MWCNT一样具有较高的比表面积（2630 m2/g）及导电性能[8-9]，但其不溶于水，易聚集。本研究使用[BMIM][PF6]-NH2与石墨烯反应，解决了这个问题，得到溶解均匀的离子液体石墨烯。加入石墨烯、MWCNT及纳米金可弥补CHI导电性较差的缺陷。从层层修饰电极的循环伏安图可以看出：未组装前裸电极由于缺乏电子媒介体，CV图为一对平坦的氧化还原峰曲线，通过层层修饰后，电极的峰电流逐渐增大，结果证明电极通过层层修饰后具有良好的电化学特性。由于不适合的pH值及H2O2浓度会影响抗原及抗体的活性，同样，抗体孵育温度及时间会影响抗原抗体结合效率，从而影响整个实验的效果。因此，需对以上条件进行优化实验。本研究结果显示，在最佳实验条件下，传感器电极的响应电流与RV-IgM浓度的对数值具有较好的负相关关系。与现有检测方法比较，具有较高的灵敏度（检测限为40 fg/mL）、较好的精密度和正确度[11-12]。如使用成品的组装电极，整个检测时间可缩短至30～40 min，所以该方法不失为一种检测RV-IgM的良好方法。但组装好的成品免疫电极的稳定性也许会对检测结果有所影响，目前我们未做这方面的研究，如果成品免疫电极在4℃的稳定性能能超过半年，则可广泛应用于RV-IgM的临床检测。

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（收稿日期：2017-01-21 本文编辑：张瑜杰）