欧宁江+董良哲+欧炎萍+陈绚+李国辉+李军+蔡永林+汤敏中

[摘要] 目的 探讨纤维蛋白原（Fg）基因多态性及其单倍型与脑梗死的关系。 方法 选取梧州市红十字会医院2014年1月～2015年11月确诊脑梗死患者255例作为病例组，选取同期262例健康体检者作为正常对照组，运用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析技术进行βBcl-1 G/A和αTaq-1位点基因分型，运用Taqman实时荧光定量PCR探针法进行448G/A、-148C/T、- 455G/A、- 854G/A、rs6050进行基因分型，运用核苷酸序列测定对1211A/G、1202C/T进行分析，采用Haploview软件进行基因单倍型的构建及分析，用Clauss法测定血浆Fg水平。 结果 9个纤维蛋白原基因位点中，-455G/A多态性的基因型频率和等位基因频率在病例组和对照组之间的差异有高度統计学意义（P < 0.01），448G/A、-148C/T、-854 G/A核苷酸多态性的基因型频率、等位基因频率在病例组和对照组间的差异无统计学意义（P > 0.05）。-455A携带者患脑梗死的相对危险度比非携带者大5.203倍。1211A/G、1202C/T均为野生型，没有发现突变位点。单倍型分析结果显示-455G/A与-148C/T及448G/A三个位点存在紧密连锁，其构成的单倍型与脑梗死的发生呈正相关，其中单倍型ATA、ATG有高度统计学意义（P < 0.01）。 结论 Fg基因与脑梗死发生的存在显著的单倍型相关性，Fgβ-455G/A、-148C/T、448G/A 可能是人群中与脑梗死关联的危险因素。

[关键词] 纤维蛋白原；基因多态性；脑梗死；连锁不平衡；单倍型

[中图分类号] R743.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）05（b）-0068-05

[Abstract] Objective To discuss the relationship between fibrinogen （Fg） gene polymorphism and its haplotype with cerebral infarction. Methods From January 2014 to November 2015， in Wuzhou Red Cross Hospital， 255 patients with cerebral infarction were selected as case group， and at same time， 262 healthy persons were selected as control group. βBcl-1 G/A and αTaq-1 site gene typing were taken by polymerase chain reaction （PCR） -restricted fragment length polymorphism analysis technology， Taqman real-time fluorescence quantification PCR probe method was applied to take 448G/A， -148C/T， -455G/A， -854G/A， rs6050 for gene typing， 1211A/G， 1202C/T were analyzed by nucleotide sequence determination， the establishment and analysis of gene haplotype were made by Haploview software， and finally Clauss method was taken to measure blood-plasma Fg level. Results In 9 Fg genetic locus， the difference of genotype frequency and allele frequency of -455G/A polymorphism between case group and control group was statistical significance （P < 0.01）， the differences of genotype frequency and allele frequency of 448G/A， -148C/T， -854G/A nucleotide polymorphism between case group and control group were no statistical significance （P > 0.05）. The relative risk of -455A carriers suffering from cerebral infarction was 5.203 times higher than that of non-carriers. Both 1211A/G， 1202C/T were wild types， mutation sites were not found. Haplotype analysis result showed that close linkage was in 3 sites that-455G/A， -148C/T， 448G/A， haplotype formed by it and occurrence of cerebral infarction had significant positive correlation， and haplotype ATA and ATG had statistically significant differences （P < 0.01）. Conclusion Fg gene and cerebral infarction occurrence had significant haplotype correlation， Fgβ-455G/A， -148C/T， 448G/A may be the risk factors of people associated with cerebral infarction.

[Key words] Fibrinogen； Gene polymorphism； Ischemic stroke； Linkage disequilibrium analysis； Haplotype

脑血管病是人类主要的病残和死亡原因，流行病学显示中青年脑血管病发病率有逐年递增的趋势，2/3的脑血管病是由于动脉粥样硬化而致的缺血性脑血管病。近年来，大量的研究表明血浆纤维蛋白原（Fg）是血栓性疾病发生、发展的重要独立危险因素，Fg基因多态性可导致个体血浆Fg水平的差异，并可能与缺血性疾病的发生有关。本文采用病例对照的研究方法对脑梗死患者Fg基因的9个多态性位点进行检测，并采用单倍型分析的方法进一步探讨Fg遗传标志物与脑梗死的关系及其临床应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取梧州市红十字会医院2014年1月～2015年11月确诊脑梗死患者255例作为病例组，选取同期262例健康体检者作为正常对照组。病例组：男148例，女107例，年龄28～98岁，平均（68.2±11.4）岁，均符合全国第四届脑血管疾病会议修订的诊断标准，所有病例均经影像学确诊，体检及实验室检查无其他心脑血管疾病。正常对照组：男141例，女121例，年龄35～80岁，平均（64.0±10.2）岁，无心脑血管、肝、肾、甲状腺疾病及糖尿病史，采血前1个月无服药史。

1.2 检测方法

1.2.1 标本采集 晨起空腹抽取静脉血1.8 mL于109 mmol/L枸橼酸钠抗凝管中，混匀，在2 h内经离心分离血浆，收集白细胞富集层血细胞，置-20℃保存。

1.2.2 Fg水平检测 使用希森美康CS-5100全自动血凝仪和西门子试剂，采用Clauss法，样本采集后4 h内完成检测。

1.2.3 DNA制备 取血细胞200 μL，按TIANamp Blood DNA Kit（离心柱型）血液基因组DNA提取试剂盒说明书（Tiangen Biotech[Beijing]CO.LTD）提取基因组DNA，置-20℃保存。

1.2.4 聚合酶链反应（PCR） 各引物序列及内切酶、单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）编号（ID）详见表1。

1.2.5 PCR扩增 PCR反应总体系为40 μL，其中包含5×PCR缓冲液8 μL，10mmol/L dNTP 0.8 μL，25 mmol/L MgCl2 0.8 μL，上游引物、下游引物各0.8 μL，TaqDNA聚合酶0.2 μL，DNA 50 ng（5 μL），去离子水23.6 μL。Bcl-1 G/A扩增循环参数：95℃预变性3 min ，然后按95℃ 15 s、62℃ 15s、72℃ 60 s共5循环，接着95℃ 15 s、58℃ 15 s、72℃ 60 s共26循环，最后72℃延长7 min。αTaq-1扩增循环参数：95℃预变性7 min，然后按94℃ 55 s、54℃ 50 s、72℃ 50 s共5循环，接着94℃ 55 s、58℃ 50 s、72℃ 50 s共27循环，最后72℃延长5 min。1211A/G和1202C/T扩增循环参数：95℃预变性5 min，然后按95℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃ 30 s共30循环，最后72℃延长，1 0 min。PCR扩增后取2 μL PCR产物行1.5%琼脂糖凝胶电泳分析，110 V 30 min，在紫外灯下鉴定。使用美国ABI公司Veriti 96cellThemal Cycler PCR扩增仪，北京六一仪器厂DYY-6C型电泳仪，美国BIO-RAD Molecular Imager凝胶成像仪。

1.2.6 限制性酶切PCR 扩增产物 酶切反应总体系为20 μL，其中包括酶切缓冲液2 μL，内切酶0.5 μL，PCR 产物10 μl，去离子水7.5 μL。Bcl-1G/A酶切反应参数：50℃ 15 min。αTaq-1酶切反应参数：65℃ 60 min。随后取5 μL酶切产物行1.5%琼脂糖凝胶电泳，100 V 30 min ，在紫外灯下鉴定。

1.2.7 Taqman探针检测程序 本实验采用Taqman MGB探针实时荧光定量多聚酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）探针法进行基因分型，检测位点包括448G/A、-148C/T、-455G/A、-854G/A、rs6050，总反应体系为11 μL，其中包括2×緩冲液5 μL，40×Probes0.25 μL，DNA1 μL（10 ng/μL），去离子水4.75 μL。使用ABI7500基因扩增仪，SNP genotyping程序进行检测（检测时长90 min）。

1.2.8 基因测序 基因位点1202C/T和1211A/G的扩增产物与引物一起送华大基因生物科技（深圳）有限公司进行基因双向序列测定。

1.3 统计学方法

采用统计软件SPSS 22.0对数据进行分析，用基因记数法计算各组基因型频率和等位基因频率。采用Haploview 4.2软件进行Hardy-Weinberg 平衡检验（Hardy-Weinberg，HW）。正态分布计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；计数资料以率表示，采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Hardy-Weinberg平衡检验

9个多态性的检测分析发现Fgβ448G/A、-148C/T、- 455G/A、-854G/A基因位点符合H-W平衡，因此随后的多态性分析及单倍型分析均基于这4个位点进行。在梧州人群中1211A/G、1202C/T均为野生型，不具有位点多态性，所以不再作进一步分析。

2.2 4个位点SNPs基因型和等位基因频率的分布

β-455G/A多态性的基因型频率、等位基因频率在病例组和对照组之间的差异有高度统计学意义（P < 0.01），比值比（OR）分别为5.20和1.64，95%置信区间（95%CI）分别为2.43～11.13、1.21～2.22，其余3个位点多态性的基因型频率、等位基因频率在病例组和对照组间的差异无统计学意义（P > 0.05）。见表2～5。

2.3 PCR扩增产物的酶切电泳结果

βBcl-1 G/A、αTaq-1位点PCR产物的酶切电泳结果详见图1～2。

2.4 4个位点突变基因型血浆Fg水平的比较

血浆Fg水平在不同基因型分组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表6。

2.5 单倍型分析

单个位点分析时β-455G/A多态性与脑梗塞关联，且与-148C/T和448G/A存在紧密连锁，连锁不平衡参数D'分别为：-148C/T和448G/A （1.0），448G/A与-455G/A（0.977），-148C/T与-455G/A（0.984）。见图3（封三）。3个基因多态性位点构建的主要单倍型与脑梗塞的发生呈正相关，其中单倍型ATA、ATG差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见表7。

3 讨论

人群Fg基因多态性频率的分布存在种族、地区差异，一个集合了Pubmed、Embase以及4个中国数据库的总共45篇文献meta分析[1]结果显示，Fgβ-455G/A基因型频率（AA+GA，GG）与IS风险关联具有统计学意义（OR=1.52，95%CI：1.28～1.80）。Martiskainen等[2]历时12.5年对486例芬兰绝经后妇女（55～71岁）脑卒中病例随访发现，携带-455A与脑卒中发作后的生存风险相关，而Golenia等[3]的研究显示β-455G/A基因多态性不是波兰人IS发生的相关风险因素。因此，我们选择可能影响血浆Fg水平或功能的9个位点，对梧州地区部分人群进行Fg基因多态性及单倍型相关性分析，以研究Fg基因多态性位点与脑血管疾病的关系，了解不同基因型个体的遗传易感性。

本研究在广西壮族自治区梧州人群当中共检出7个多态性位点，对于其中不符合H-W平衡的位点（βBcl-1G/A、αTaq-1、rs6050），不再继续对检测数据进行分析。Fgα链1211A/G、1202C/T均为野生型，其突变多见于遗传性异常纤维蛋白缺陷症的报道[4-5]，表现为纤维蛋白原功能或量的异常。Chudakova等[6]报道在-455位点携带A等位基因者，血浆Fg测定值较高。本研究数据显示-455（GA+AA）组Fg血浆水平（3.20 g/L）比-455（GG）组（2.98 g/L）略高，但没有显著差异（P = 0.257），与国内相关报道也存在差距[7]。这可能与Fg的检测方法学差异有关，但仍提示在临床上对于携带-455A者，应密切监测其血浆Fg水平，以便及时采取有效的诊治措施，预防缺血性心脑血管疾病的发生。448G/A、-148C/T、-455G/A、-854G/A均位于Fg的编码基因FGB启动区，近年来研究认为，位于启动子区的SNPs可能直接影响该基因的表达水平。分析各多态性位点的等位基因分布情况，我们发现，本研究队列中病例组-455A基因频率（0.368）与报道相近，略高于山东青岛地区（0.304）[8]、广东湛江地区（0.302）[9]、新疆维吾尔族（0.293）和汉族（0.232）[10]、河北唐山地区（0.248）[11]，对照组-455A频率0.267，略高于天津地区（0.185）[12]、北京地区（0.207）[13]，而与广东地区广州籍人（0.276）[14]接近；无论从基因型频率和等位基因频率的分布来看，-455A携带者患脑梗死的相对危险度比非携带者高（P < 0.01），OR值分别为5.20和1.67，与文献报道其它区域人群的研究结果相近[7]。病例组中其余位点的最小等位基因（MAF）-148T（0.284），与河北唐山地区（0.307）[11]和广东（0.303）[15]接近而低于湖南汉族（0.325）[16]；448A（0.274）略高于于湖南郴州地区（0.204）[17]，-854A（0.053）的频率也与上海地区（0.049）[18]接近。

关于其作用机制，De Maat等[19]发现-455G/A位点的AA基因型患者冠状动脉粥样硬化的进展很快，推测该基因型通过增高血浆Fg水平而导致冠状动脉疾病的进展。Martiskainen等[20]发现，-455A等位基因多存在于多病灶性（病灶≥3个）小动脉粥样硬化性脑梗死的个体，而G/A基因多态性在大动脉粥样硬化性脑梗死中未显示出统计学意义。Ajjan等[21]发现，将Bβ448位的Arg突变为Lys后，形成的纤维蛋白更细，孔径更小，且由其形成的凝块更坚固且不易溶解。单倍型分析可以直接提示基因在染色体上的连锁关系，通过单倍型分析可以发现与疾病易感性相关的核苷酸多态性[7]，本文数据显示，-455G/A、-148C/T、448G/A呈紧密连锁，β-455G/A、-148C/T和448G/A基因多态性位点构建的主要单倍型与脑梗死的发生呈正相关，其中病例组的ATA单倍型频率（63.3%）显著低于对照组（71.8%）（P < 0.01），而病例组的ATG单倍型频率（9.2%）则显著高于对照组（0.8%）（P < 0.01）。研究数据显示梧州人群中，Fg基因单倍型与脑梗死呈现独特的单倍型相关，携带ATG单倍型的个体（OR=12.61，P < 0.01）其发病风险性显著高于携带单一多态性位点突变的个体（OR=5.20，P < 0.01）。

因此，本研究組认为，进行疾病等位基因多态性位点及单倍型表达的研究有助于对其遗传特性的分析。可以肯定的是，Fg基因多态性与环境因素的协同作用，使某些基因型个体更容易受环境因素的影响，从而增加血栓性疾病发生的危险。因此，选择性多位点Fg基因多态性的联合检测，对于早期发现缺血性心脑血管疾病的易感个体并探索个体化的干预治疗具有十分重要的意义。

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（收稿日期：2017-02-17 本文編辑：苏 畅）