刘 洪 刘海玲 彭文剑 肖纬宇

(湛江市第二人民医院肿瘤科，广东 湛江 524012)

自噬基因Beclin1和微管相关蛋白轻链3与胃癌的关系研究*

刘 洪 刘海玲 彭文剑 肖纬宇

(湛江市第二人民医院肿瘤科，广东 湛江 524012)

目的 研究胃部非癌组织、胃部癌旁组织与胃部癌组织中自噬基因Beclin1和微管相关蛋白轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3, MAPLC3)基因的表达含量，确定Beclin1和MAPLC3表达含量与胃癌之间的联系。方法 使用实时逆转录-聚合酶链反应(Real-Time reverse transcription polymerase chain reaction, Real-Time RT-PCR)检测胃部非癌组织、胃部癌旁组织与胃部癌组织中Beclin1以及MAPLC3基因的 mRNA表达含量。使用蛋白质印迹法(Western blot)方法检测胃部非癌组织、胃部癌旁组织与胃部癌组织中Beclin1以及MAPLC3基因的蛋白表达含量。结果 与胃部非癌组织相比，胃部癌旁组织Beclin1以及MAPLC3的mRNA含量显著降低(P<0.01)，胃部癌组织中Beclin1以及MAPLC3的mRNA含量也显著降低(P<0.01)；与胃部癌旁组织相比，胃部癌组织中Beclin1以及MAPLC3的mRNA含量也显著降低(P<0.05)。与胃部非癌组织相比，胃部癌旁组织Beclin1以及MAPLC3的蛋白含量显著降低(P<0.05)，胃部癌组织中Beclin1以及MAPLC3的蛋白含量也显著降低(P<0.01)；与胃部癌旁组织相比，胃部癌组织中Beclin1以及MAPLC3的蛋白含量也显著降低(P<0.05)。结论 自噬相关基因Beclin1以及MAPLC3的mRNA和蛋白水平在胃癌组织中表达降低，这提示自噬相关基因与胃癌的发生、发展密切相关。

自噬基因；Beclin1；微管相关蛋白轻链3；胃癌

自噬机制是细胞进行物质代谢的一种重要方式，其广泛存在于单细胞生物以及多细胞的动、植物中，有效组成机体的降解和再循环系统。当自噬调控机制出现失常时可以引发多种疾病，包括恶性肿瘤、自身免疫病、肌细胞功能失调以及衰老等病症[1]。自噬与肿瘤之间的关系研究成为现如今比较热门的研究方向，自噬与肿瘤之间的关系研究存在不尽相同的观点[2-3]。Beclin1和微管相关蛋白轻链3 (MAPLC3)这2种基因参与编码自噬相关的蛋白，在自噬过程中发挥重要作用[4]。本研究通过检测胃部非癌组织、胃部癌旁组织以及胃部癌组织中Beclin1和MAPLC3含量来确定自噬与胃癌之间的联系，对研究结果进行探究。

1 资料与方法

1.1 患者资料以及标本采集 我院2015年3月至2016年8月收治的5例胃癌患者，所有患者均经过病理学检查得以确诊，5例患者手术前均为接受过化疗或者放疗治疗。选取5例患者的胃癌组织、距肿瘤边缘2 cm左右的癌旁组织以及距肿瘤边缘超过5 cm的非癌组织。手术切除的组织标本迅速适应冰生理盐水洗净，然后迅速放入EP管中并及时储存于液氮中备用。

1.2 主要试剂 Beclin1(美国Santa Cruse公司)一抗为山羊抗人，一抗浓度为1∶500；MAPLC3(美国Santa Cruse公司)一抗为山羊抗人，一抗浓度为1∶500。碱性磷酸酶标记的二抗(二抗浓度为1∶1000)敷育后使用NBT/BCIP显色液膜上显色并扫描。扫描后使用BIO-RAD公司的Quantity One一维分析软件进行图像灰度分析。

PCR引物购自上海生工上海生工生物工程有限公司。逆转录PCR试剂盒购自Thermo公司。SYBR Premix Ex TaqTM II购自宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa Code：DRR820A)。

1.3 RNA提取、逆转录以及实时定量RT-PCR方法 选取1 mm的冻存标本进行剪碎并研磨，使用1 ml的invitrogen公司的Trizol溶液进行裂解，按照invitrogen公司的产品说明书使用一步法提取总RNA,然后使用分光光度计测定RNA的浓度以及纯度。使用Thermo公司的试剂以及产品说明书合成cDNA以备用，使用GAPDH作为内参，引物序列为: 5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′(上游),5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′(下游)。Beclin1序列为: 5′-ATCCTGGACCGTGTCACCATCCAGG-3′(上游) , 5′-GTTGAGCTGAGTGTCCAGCTGG-3′(下游)；MAP-LC3序列为: 5′-GAAGATGTCCGACTTATTCGAGAG-3′(上游), 5′-ACTCTCATACACCTCTGAGATTGG-3′(下游)。反应体系如下：(1)在0.2 ml PCR管中加入以下试剂：5 ml total RNA，1 ml Random Primer p(dN)6(0.2 mg/ml)，5 ml Rnase-free ddH2O；(2)70°C温浴5 min；(3) 冰浴10 s，离心后加入以下试剂：4.0 ml 5×Reaction Buffer，2.0 ml dNTP Mix(10 mmol/L)，1.0 ml Rnase inhibitor(20 U/ml)，2.0 ml AMV Reverse Transcriptase(10 U/ml)，20.0 ml Total volume；(4)37 ℃加热块中温浴5 min；(5)42 ℃加热块中温浴60 min；(6)70 ℃加热块中温浴10 min，冰浴终止反应；(7)逆转录得到的cDNA在-80 ℃保存。

实时定量PCR反应体系：反应体系包括：2×SYBRGreen qPCR Master Mix 10 μl, 1 μl的10 μM上游引物, 1 μl的10 μM下游引物，7 μl的ddH2O, 1 μl的模板cDNA,配置成20 μl的总反应体系。反应条件：95 ℃ 3 min(一个循环)；95 ℃，15 s, 60 ℃，40 s(40个循环)。

1.4 Western blot检测 组织样品研磨后进行蛋白定量，然后使用2X的蛋白裂解液 loading buffer冰上裂解蛋白，实验前用沸水煮5～10 min, 使用10%的SDS-PAGE电泳，20 μg的蛋白上样量，恒压15 V半干式电转仪进行电转(使用醋酸纤维膜)。5%脱脂奶粉封闭1 h后加一抗过夜。次日使用1×TBST洗膜3次(每次10 min)，加入二抗(1∶1000)，在室温敷育2 h。1×TBST洗膜3次后使用NBT/BCIP显色液膜上显色并扫描。扫描后使用BIO-RAD公司的Quantity One一维分析软件进行图像灰度分析(用GAPDH作为内参)。

1.5 统计学分析 采用SPSS18.0作统计学分析, RT-PCR和Western blot结果使用F检验(单向方差分析),α=0.05作为显著性检验水准。

2 结 果

2.1 胃部非癌组织、胃部癌旁组织与胃部癌组织中Beclin1的mRNA相对表达含量 与胃部非癌组织相比，胃部癌旁组织Beclin1的mRNA含量显著降低(P<0.01)，胃部癌组织中Beclin1的mRNA含量也显著降低(P<0.01)；与胃部癌旁组织相比，胃部癌组织中Beclin1的mRNA含量也显著降低(P<0.05)。见图1。

图1 胃部非癌组织(normal)、癌旁组织(adjacent non-

2.2 胃部非癌组织、胃部癌旁组织与胃部癌组织中MAPLC3的mRNA相对表达含量 与胃部非癌组织相比，胃部癌旁组织MAPLC3的mRNA含量显著降低(P<0.01)，胃部癌组织中MAPLC3的mRNA含量也显著降低(P<0.01)；与胃部癌旁组织相比，胃部癌组织中MAPLC3的mRNA含量也显著降低(P<0.05)。见图2。

图2 胃部非癌组织(normal)、癌旁组织(adjacent non-

2.3 胃部非癌组织、胃部癌旁组织与胃部癌组织中Beclin1的蛋白相对表达含量 与胃部非癌组织相比，胃部癌旁组织Beclin1的蛋白含量显著降低(P<0.05)，胃部癌组织中Beclin1的蛋白含量也显著降低(P<0.01)；与胃部癌旁组织相比，胃部癌组织中Beclin1的蛋白含量也显著降低(P<0.05)。见图3。

2.4 胃部非癌组织、癌旁组织与癌组织中MAPLC3的蛋白相对表达含量 与胃部非癌组织相比，胃部癌旁组织MAPLC3的蛋白含量显著降低(P<0.05)，胃部癌组织中MAPLC3的蛋白含量也显著降低(P<0.01)；与胃部癌旁组织相比，胃部癌组织中MAPLC3的蛋白含量也显著降低(P<0.05)。见图4。

图3 胃部非癌组织(normal)、癌旁组织(adjacent non-cancerous)以及癌组织(tumor)中Beclin1的蛋白表达含量

图4 胃部非癌组织(normal)、癌旁组织(adjacent non-cancerous)以及癌组织(tumor)中MAPLC3的蛋白表达含量

3 讨 论

自噬现象普遍存在于各种细胞，参与细胞的增殖、生长以及肿瘤发生等过程。自噬可以促进细胞内大分子的循环利用，对受损细胞器进行清除，有效促进细胞内环境的稳态[5]。自噬是细胞器以及大分子蛋白降解的重要途径，ATG系列基因则与自噬体的形成密切相关[6]。

Beclin1是ATG6的同系物,在哺乳动物中作为特异性基因参与自噬过程。Beclin1基因位于人类染色体17q21上,该基因与Ⅲ型PI3K结合形成复合体，复合体可以有效调节其他的ATG蛋白，调节ATG蛋白在自噬前体结构中定位，对自噬活性进行调节[7]。Beclin1作为抑癌基因，参与肿瘤的发生与发展，卵巢癌、乳腺癌以及前列腺癌细胞中存在Beclin1基因缺失或者突变。敲除Beclin1等位基因后小鼠自发性恶性肿瘤的发生概率显著上升，也易受到HBV造成的损伤[8]。

MAPLC3是ATG8基因的同源物，在哺乳动物细胞中广泛存在，在前自噬泡以及自噬泡膜表面显著表达，在自噬体的形成过程中发挥重要作用，可以作为自噬体的特异性标记蛋白[9]。MAPLC3在自噬泡形成过程中参与了由Atg家族组成的两条泛素样蛋白的修饰与加工过程。自噬泡形成后MAPLC3继续与自噬泡膜表面结合并发挥重要作用[10]。

自噬相关基因在肿瘤的不同发展阶段表达含量不尽相同，不同的研究者的研究结果并不完全一致。本研究通过检测胃部非癌组织、胃部癌旁组织与胃部癌组织中自噬相关基因Beclin1和MAPLC3的表达，确定自噬相关基因Beclin1和MAPLC的mRNA和蛋白的表达情况。Beclin1和MAPLC3的mRNA和蛋白的表达含量在胃癌组织中显著下降，这一研究结果提示肺癌组织、细胞中自噬现象显著下降。这一研究结果也与自噬可以抑制肿瘤发生、发展研究结果相同，阻断自噬则会导致肿瘤的发生与发展，而恶性肿瘤中的自噬相关基因出现单染色体缺失,表达含量出现显著降低。自噬可以有效调节细胞内过氧化物的含量，有效保持细胞内环境稳定，促进蛋白代谢紊乱状态有效恢复，有效抑制肿瘤的发展。此外，自噬可以降低氧化应激,降低致瘤性突变的发生。此外，PI3K以及mTOR等信号通路与自噬的抑制与发生密切相关，mTOR信号通路中的很多抑癌基因(TSC2、PTEN以及p53)等可以有效促进细胞自噬[11]。

我们的研究结果与这些报道结果一致。可以认为，自噬相关基因Beclin1以及MAPLC3的mRNA和蛋白水平在胃癌组织中表达降低,这提示自噬相关基因与胃癌的发生、发展密切相关。

[1] 李冉,李磊,刘江,等. Beclin 1与LC3蛋白在腮腺多形性腺瘤及腮腺癌在多形性腺瘤中的表达和意义[J].第三军医大学学报,2012,13(13):1293-1296.

[2] 张晶,舒丽莎,张林西.自噬通路中mTOR和Beclin1与肿瘤关系的研究进展[J].河北医药,2016,18(12):2837-2840+2844.

[3] 唐杨烽,韩林,徐激斌,等. A型主动脉夹层组织Beclin1及微管相关蛋白1轻链3的表达及意义[J].第二军医大学学报,2013,9(19):946-948.

[4] 刘斌,唐静,袁敏,等.血管性痴呆大鼠海马CA1区自噬及微管相关蛋白1轻链3的表达[J].第二军医大学学报,2013,9(13):940-945.

[5] 张娟,赵曼曼,李冉,等.微管相关蛋白1轻链3及Beclin-1在硅沉着病大鼠肺泡巨噬细胞中的表达[J].解剖学报,2014,5(7):646-651.

[6] 刘金霞,马原源,刘斌,等.微管相关蛋白1轻链3Ⅱ与微管相关蛋白2在血管性痴呆大鼠海马CA1区的表达[J].中国康复理论与实践,2015,5(31):497-500.

[7] 张建凯,张小平,褚迎欣.自噬基因微管相关蛋白1轻链3、Beclin 1在饥饿大鼠心肌中的表达及意义[J].疑难病杂志,2015,7(14):719-722+771.

[8] 丁艳菊,陆爽,吴君,等.蓝莓对肝纤维化大鼠肝组织自噬相关蛋白LC3和Beclin1表达的影响[J].世界华人消化杂志,2016,9(6):1321-1330.

[9] 俞雪锋,蒋曦,王国康,等.阿魏酸对脊髓损伤大鼠微管相关蛋白轻链3、Beclin1、Bcl-2和Bax表达的影响[J].中国药理学与毒理学杂志,2016,7(14):714-722.

[10] Zhang Z, Tian H, Miao Y,et al.Functional results of microvascular reconstruction after hemiglossectomy: free anterolateral thigh flap versus free forearm flap[J]. Biochemistry (Mosc)， 2016,81(6):574-582.

[11] Rodriguez M, Kaushik A, Lapierre J,et al. Electro-Magnetic Nano-Particle Bound Beclin1 siRNA Crosses the Blood-Brain Barrier to Attenuate the Inflammatory Effects of HIV-1 Infection in Vitro[J].J Neuroimmune Pharmacol，2016,15(5):351-355.

The study on the relationship of Beclin1 and microtubule associated protein light chain 3 with gastric cancer

LIU Hong LIU Hai-ling PENG Wen-jian XIAO Wei-yu

(Center of Oncology, the Second People's Hospital of Zhanjiang, Zhanjiang, Guangdong 524012, China)

Objective: To study the non stomach cancer tissue, autophagy gene Beclin1 and microtubule stomach tissues and gastric cancer associated protein light chain 3 (microtubule-associated protein 1 light chain 3, MAPLC3) expression levels of genes, and determine Beclin1 and MAPLC3 expression between gastric cancer and content contact. Methods: The real-time reverse transcription polymerase (Real-Time reverse transcription poly chain reaction Merase chain reaction, Real-Time RT-PCR) was used to detect gastric non cancer tissues, Beclin1 stomach tissues and the stomach cancer tissue and MAPLC3 gene mRNA expression content. Using Western blotting (Western blot) method was used for detection of gastric non cancer tissue the expression of Beclin1 of gastric tissues and gastric cancer tissues, MAPLC3 protein content. Results: Compared with non stomach cancer, the mRNA contents of stomach cancer tissues and Beclin1 MAPLC3 were significantly decreased (P<0.01), stomach carcinoma Beclin1 and MAPLC3 content of mRNA was lower (P<0.01); and stomach carcinoma, stomach carcinoma Beclin1 and MAPLC3 content of mRNA was lower (P<0.05). Compared with the non stomach cancer tissue, stomach cancer adjacent tissue Beclin1 and MAPLC3 protein content was significantly reduced (P<0.05), gastric carcinoma Beclin1 and MAPLC3 protein content also decreased significantly (P<0.01); Compared to noncancerous tissues, gastric carcinoma Beclin1 and MAPLC3 protein content also decreased significantly (P<0.05). Conclusion: The autophagy related gene Beclin1 and MAPLC3 mRNA and protein expression decrease in gastric cancer tissues, suggesting that autophagy related genes are closely related with gastric carcinogenesis and development.

autophagy gene; Beclin1; microtubule associated protein light chain 3; gastric cancer

刘洪，男，主治医师，主要从事肿瘤内科化疗工作。

R735.2

A

1004-7115(2017)05-0484-04

10.3969/j.issn.1004-7115.2017.05.002

2016-12-03)