李 雅，荣守华，智艳芳，樊婷婷，邱 翠，李肖甫

郑州大学第三附属医院细胞室 郑州 450052

正常宫颈上皮细胞原代培养体系的改良*

李 雅，荣守华，智艳芳，樊婷婷，邱 翠，李肖甫#

郑州大学第三附属医院细胞室 郑州 450052

#通信作者，男，1964 年7 月生，硕士，教授，研究方向：肿瘤细胞病理学，E-mail：lixiaofu1964@163.com

原代培养；宫颈上皮细胞；中性蛋白酶；角质细胞无血清培养基

目的：探索一种高效、可重复的正常宫颈上皮细胞原代培养方法。方法：取60例正常宫颈组织，分成2组，分别采用Ⅱ型中性蛋白酶联合0.25 g/mL胰蛋白酶-EDTA(中性蛋白酶联合法)及Ⅰ型胶原酶消化分离后进行原代培养，比较两种分离效果；观察采用中性蛋白酶联合法消化不同时间对分离效果的影响。观察添加体积分数5%FBS dK-SFM培养基与单纯dK-SFM培养基培养原代宫颈上皮细胞的生长曲线差异，并用形态学、广谱角蛋白免疫细胞化学染色鉴定细胞来源。结果：正常宫颈上皮细胞原代培养总成功率为40%。中性蛋白酶联合法成功率、分离所得细胞密度、原代细胞融合时间及细胞纯度均高于Ⅰ型胶原酶消化法(P<0.05)。中性蛋白酶消化20 h的分离效果优于消化16和24 h(P<0.05)。体积分数5%FBS dK-SFM培养基原代培养的宫颈上皮细胞增殖活性高于单纯dK-SFM培养基(P<0.05)。细胞生长状况良好，可在体外传代至5～6代，并可冻存与复苏，免疫细胞化学染色显示广谱角蛋白表达阳性。结论：Ⅱ型中性蛋白酶联合0.25 g/mL胰蛋白酶-EDTA分离法和体积分数5% FBS dK-SFM培养基培养原代正常宫颈上皮细胞，高效、可重复性好。

刚离体的原代细胞保留有原有的生物学遗传特性，能反映体内细胞生长的一般特征，适用于药物及癌症治疗等研究[1-2]。正常宫颈上皮细胞原代培养对于深入研究人类乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)在宫颈癌发生发展中的作用机制至关重要。从理论及实际操作的角度而言，建立正常宫颈上皮细胞及携带HPV的宫颈上皮细胞的体外细胞模型，有利于更好地了解HPV 感染宫颈上皮细胞的病理改变，而且较体内动物实验更为简便易行。……