朱莲花+凌蕾

摘 要 目的：选择适宜方法对多种直接接触药品的包装材料微生物限度进行检查，并对方法的适用性进行验证。方法：对固体药用聚丙烯瓶等数种药品包装材料按照相应药品包装材料国家标准和中国药典2015年版四部附录通则的要求进行微生物限度方法适用性验证。结果：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽胞杆菌、白色念珠菌和黑曲霉五种标准菌株在菌落计数法验证试验中的回收率为60%～150%，符合药典规定。在控制菌的方法验证试验中，均可检出相应的试验菌。结论：选定的方法适用于不同的药品包装材料的微生物限度检测。

关键词 药品包装材料 微生物限度检查 适用性验证

中图分类号：R951 文献标识码：A 文章编号：1006-1533（2017）09-0073-03

Applicability verification of microbial limit test method for different drug packaging materials

ZHU Lianhua*， LING Lei（Shanghai Food and Drug Packaging Material Control Center， Shanghai 201203， China）

ABSTRACT Objective： To verify the applicability of the appropriate method for microbial limit test on different drug packaging materials. Methods： The microbial limit test and the validation test for the determination of the microbial contamination on pharmaceutical packaging materials such as the solid medicinal polypropylene bottle were performed based on the regulations of the National Standard Packaging Method and Chinese Pharmacopoeia 2015 edition. Results： The recovery rates of five standard strains Staphylococcus aureus， Pseudomonas aeruginosa， Bacillus subtilis， Candida albicans and Aspergillus niger were in the range of 60% ～150% by the colony count method， which meet the requirements of Chinese Pharmacopoeia. The corresponding test strains cold be detected by the validation test of control bacteria when they were incubated for a certain time at appropriate temperature. Conclusion： The selected method can be applied to the microbial limit test for the determination of the microbial contamination on different drug packaging materials.

KEy WORDS drug packaging material； microbial limit test； applicability verification

直接接觸药品的包装材料及容器既具备了盛药品的功能，也因为其与药品的接触而可能影响药品的质量。微生物污染是药品包装容器可能给药品质量带来的风险之一，因此，为了确保药品的安全有效，必须严格控制包装容器的微生物污染程度[1-2]。药品包装材料微生物限度检验主要是通过对附着在容器或材料表面的微生物进行采集和检验[3-4]，而药品包装容器的材料组成成分、生产工艺、贮存条件等各种因素都会对附着的微生物数量和种类带来影响[5-6]。同时，检验方法中对样品表面附着微生物的采集方法——即供试液制备过程中涉及的提取介质及具体制备方法都可能对微生物造成一定的损伤从而影响微生物生长，可能给检验的准确性带来影响。微生物检验结果的准确性还受到其他多种因素的影响，如样本分布均匀性、样品溶液制备过程中微生物收集的有效性、检验方法的灵敏度等，这些内容一般已经在标准方法中有详细的规定从而确保检验方法的科学性。但各个实验室仍需对标准方法在本实验室的适用性进行验证，从而确保本实验室的人员操作、实验环境、培养基和试剂等各个环节不会对该方法的结果造成影响，从而保证检测结果的准确性[7-10]。

1 仪器与材料

1.1 仪器

生化培养箱Thermo 815（赛默飞世尔）；高压蒸汽灭菌锅MLS-3780（日本三洋公司）；ESCO生物安全柜Class II BSC（艺思高科技有限公司）。

1.2 实验用标准菌株

生物梅里埃定量质控菌株BioBall MultiShot 550系列，包括金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S. aureus）NCTC 10788（批号：B3651）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，P. aeruginosa）NCTC 12924（批号：B3653）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis，B. sub）NCTC 10400（批号：B3647）、白色念珠菌（Candida albicans，C. albicans）NCPF 3179（批号：B3663）、黑曲霉（Aspergillus niger，A. niger）NCPF 2275（批号：B3642）、大肠埃希菌（Escherichia coli，E. coli）NCTC 12923（批号：B3661）。

1.3 培养基及试剂

胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）干粉、胰酪大豆胨液体培养基（TSB）干粉、沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）干粉、麦康凯液体培养基干粉、麦康凯琼脂培养基干粉、溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基干粉、甘露醇氯化钠琼脂培养基干粉，均来自于上海中科昆虫生物技术开发有限公司。上述培养基适合性检查符合规定[11]。

1.4 实验样品

本实验所用样品均为日常测试样品。

1.5 菌液的制备

将不同种类的BioBall MultiShot 550标准菌株球分别倒入1.1 ml 14 d复溶液中，混匀，为实验用菌液（即500 cfu/ml标准菌株实验用菌液）。

1.6 供试液及滤膜的制备

1.6.1 垫片、膜、药用瓶、铝管等

药用聚酯/铝/聚丙烯封口垫片、外用贴膏剂用聚酯非织造布及复合膜、口服固体药用瓶、铝管及软膏管分别按国家药包材标准中YBB00132005-2015、YBB00132002-2015、YBB00082002-2015、YBB00162002-2015微生物检查项下的要求进行供试液制备后，分别取相当于技术标准中的一个单位（一片垫片、100 cm2的复合膜、一个瓶、一支铝管）的供试液进行薄膜过滤[12]。

1.6.2 气雾剂阀门

取样品10个，置于锥形瓶中，加入氯化钠注射液100 ml，振摇1 min，即得1∶10供试液。取供试品溶液10 ml进行薄膜过滤。

1.6.3 口服固体药用瓶盖

取本品10个，将无菌棉签用氯化钠注射液沾湿，在瓶盖内侧擦拭，然后立即剪断后将棉签投入盛有100 ml氯化钠注射液的锥形瓶中，换1支棉签，同法操作（即每个瓶盖用2支棉签擦拭）。将瓶快速摇晃1 min，即得1∶10供试品溶液。分别取供试品溶液10 ml进行薄膜过滤。

1.6.4 滤膜的冲洗

每张滤膜冲洗3次，每次的冲洗液体积为50 ml。

取滤膜照中国药典2015年版四部通则1105进行需氧菌总数、霉菌及酵母总数检查，照中国药典2015年版四部通则1106进行控制菌检查。

1.6.5 菌落计数和控制菌检验

需氧菌、酵母及霉菌菌落计数及控制菌E. coli、S. aureus和P. aeruginosa检验均按文献操作[11]。

1.7 方法适用性验证

需氧菌、霉菌及酵母总数计数及控制菌方法适用性验证试验按照文献操作[11]。加入的标准规定菌种量为50 cfu，即上述1.5中的菌液0.1 ml。回收率（%）=（试验组菌数–供试品对照组菌数）/菌液对照组菌数×100%。当5种标准菌的回收率均为50%～200%时，判定为合格。

2 结果

对8种药品包装材料的微生物限度试验中的需氧菌、霉菌及酵母的方法适用性验证结果显示，标准菌株的回收率均为63%～143%（表1～2）；在控制菌的验证试验中，大肠埃希菌的试验组和菌液对照组在封口垫片、药用复合膜、气雾剂阀门、口服固体药用瓶及药用瓶盖包装材料上的试验结果均是阳性，而供试品对照组则为阴性；金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的试验组和菌液对照组在非织造布、气雾剂阀门、药用复合膜、铝管和软膏管上的试验结果均是阳性，而供试品对照组则为阴性。这些结果表明，这三种控制菌的方法适用性验证结果均符合药典相关要求，而8种药品包装材料的微生物限度试验方法也均适用。

3 讨论

本实验对直接接触药品的包装容器及材料中的封口垫片、非织造布、复合膜、气雾剂阀门、口服固体药用瓶、瓶盖、软膏管、铝管8个产品的检验方法进行了适用性验证。在菌落计数法中，金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉5种标准菌株回收率均为63%～143%，符合2015年版《中国药典》四部通则1105中50%～200%的要求。大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌及铜绿假单胞菌的控制菌方法适用性验证也均符合2015年版《中国药典》四部通则1106的要求。

对不同的药品包装材料的产品，应选择合适正确的检验方法，并对所选的方法进行适用性验证，只有当方法适用性验证结果符合要求时，才能证明所选用的方法标准是合理的，检测该类产品的结果是准确有效的。但在标准中对于同类品种不同生产企业生产时是否进行方法适用性的验证未作明确规定，有待今后进一步完善[13-14]。

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