王永立　袁浩　樊淑华

摘要：【目的】利用响应面法对微波辅助提取七叶一枝花总黄酮的工艺条件进行优化，以期提高七叶一枝花总黄酮提取量，为实际生产提供技术支撑。【方法】在单因素试验的基础上，选取乙醇体积分数、液料比和微波功率3个主要影响因素进行Box-Behnken中心组合试验设计，筛选七叶一枝花总黄酮提取最佳工艺参数。【结果】建立了七叶一枝花总黄酮提取量（Y）与乙醇体积分数（A）、液料比（B）和微波功率（C）的回归模型：Y=4.90+0.30A+0.51B+0.48C-0.19AB+

0.44AC+0.24BC-0.85A2-0.83B2-0.55C2（R2=0.9734），拟合程度较高。3个影响因素及乙醇体积分数与微波功率的交互作用对七叶一枝花总黄酮提取量有极显著影响（P<0.01）；微波辅助提取七叶一枝花总黄酮的最佳工艺条件：乙醇体积分数50%、液料比17∶1、微波功率528 W，在此条件下七叶一枝花总黄酮提取量为5.28 mg/g，与预测值（5.18 mg/g）的相对误差为1.93%。【结论】以响应面法优化微波辅助提取七叶一枝花总黄酮工艺参数具有一定的可行性，可用于实际生产。

关键词： 七叶一枝花；总黄酮；微波辅助提取；响应面法；工艺优化

中图分类号： R284.2 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）04-0698-06

Abstract：【Objective】In the present study， response surface methodology was applied to optimize the process conditions for the microwave-assisted extraction of total flavonoids from Paris Polyphylla， in order to improve the extraction yield of total flavonoids and provide technique support for actual production. 【Method】Based on single factor experiments， three major parameters including alcohol volume fraction， microwave power and liquid-solid ratio were optimized using Box-Behnken certral composite design， in a bid to select the optimal process parameters for total flavonoids extraction from P. Polyphylla. 【Result】The regression model based on extraction of total flavonoids from P. Polyphylla（Y）， ethanol volume fraction（A）， liquid-solid ratio（B） and microwave power（C） was as follows：Y=4.90+0.30A+0.51B+0.48C-0.19AB+0.44AC+

0.24BC-0.85A2-0.83B2-0.55C2（R2=0.9734）. The fitting degree was high. The three parameters and interaction between ethanol volume fraction and microwave power had extremely significant influence on total flavonoids extraction yield（P<0.01）. The optimal extraction conditions were as follows： ethanol volume fraction 50%， liquid-solid ratio 17∶1 and microwave power 528 W. Under such conditions， the extraction yield was 5.28 mg/g. The relative error was 1.93% compared to the predicted yield（5.18 mg/g）. 【Conclusion】Parameters of microwave-assisted total flavonoids extraction from P. Polyphylla optimized by response surface methodology are feasible， which can be applied to actual production.

Key words： Paris Polyphylla； total flavonoids； microwave-assisted extraction； response surface methodology； process optimization

0 引言

【研究意義】七叶一枝花（Paris polyphylla）又名重楼，为百合科（Liliaceous）重楼属（Paris）植物，具有消肿止痛、清热解毒、平喘止咳、凉肝定惊等功效，传统中医常用于治疗痈肿、疮毒、咽喉肿痹、乳痈、蛇虫咬伤、跌打伤痛、肝热抽搐等症（李焘，2011；王岚等，2014）。七叶一枝花化学成分复杂，主要含有甾体皂苷、植物蜕皮激素、植物甾醇、黄酮、蚤休甾酮及多种氨基酸和微量元素，其中黄酮类物质主要包括山奈酚-

3-O-β-D-葡萄吡喃糖基-（1→6）-β-D-吡喃苷和7-O- α-L-吡喃鼠李糖基—山奈酚-3-O-β-D-葡萄吡喃糖基-（1→6）-β-D-葡萄糖苷等（童立雷，2012）。作为七叶一枝花主要的活性成分，总黄酮具有调节免疫、抗衰老、抗氧化和治疗心血管疾病等多种生理活性功能（李学坤等，2014；陈婵等，2015；杨忠飞和赵成刚，2015）。因此，开展七叶一枝花总黄酮提取工艺研究，对提高七叶一枝花药用价值具有重要意义。【前人研究进展】目前有关七叶一枝花有效成分的研究集中在甾体皂苷（李于善等，2009；童立雷，2012；喻祖文等，2013），其总黄酮含量测定及提取工艺的研究也有一些报道。王岚等（2013）通过测定梵净山七叶一枝花总黄酮含量，发现不同年限七叶一枝花的含量不同，其中8年生的总黄酮含量最高；随后又采用正交试验对乙醇超声波浸提七叶一枝花总黄酮的工艺条件进行优化，发现在最适条件（料液比1∶15、乙醇体积分数90%、浸提温度70 ℃、浸提3次）下提取获得总黄酮含量4.92 mg/g（王岚等，2014）；钟彦等（2014）对4种重楼属植物总黄酮含量进行对比分析，发现重楼中总黄酮含量受产地和品种影响较大，其中自采的毛重楼含量最高，为0.1146%；周浓等（2014）采用正交试验优化滇重楼总黄酮的提取工艺条件，结果表明，以甲醇为提取溶剂，回流提取2次，得到总黄酮含量0.0965%。【本研究切入点】总黄酮提取一般采用水提法或有机溶剂浸提法等常规方法，但这些方法提取效果差且提取率低。此外，工艺条件的优化多采用正交试验设计（王岚等，2014；陈婵等，2015；蒋华梅和石登红，2015），借助响应面分析优化七叶一枝花总黄酮提取工艺参数的研究鲜有报道。正交设计作为常用的试验设计方法，能够在已有水平条件下获取适宜的水平组合；但对于未设定的水平值而言，无法在更大范围内寻找到更为合适的工艺参数组合。响应面法则可以对所取水平的整个区域进行筛选，得到因素和水平值之间的关系及最优水平组合，结果分析更有说服力（喻俊等，2015）。【拟解决的关键问题】在单因素试验的基础上，采用响应面法优化微波辅助提取七叶一枝花总黄酮的工艺条件，篩选出最佳工艺参数组合，以期提高七叶一枝花总黄酮提取量，为实际生产提供技术支撑。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

七叶一枝花购自周口市同和堂大药房，干燥粉碎后过60目筛，于阴凉处密封备用。芦丁标准品购自中国医药集团上海化学试剂公司，亚硝酸钠、无水乙醇、氢氧化钠、硝酸铝等均为国产分析纯。主要仪器设备：WF-4000C常压微波快速反应系统（上海屹尧分析仪器有限公司）；FW100高速万能粉碎机（北京科伟永兴仪器有限公司）；SHZ-D9（Ⅲ）循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限公司）；AL204电子天平[梅特勒—托利多仪器（上海）有限公司]；UV-2600型紫外—可见分光光度计[岛津国际贸易（上海）有限公司]。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 总黄酮提取及含量测定 称取适量样品粉末置于烧瓶中，加入一定体积乙醇，在一定条件下（乙醇体积分数、液料比、微波时间和微波功率）进行微波辅助提取，溶液减压抽滤，定容后备用。以芦丁为标准品，利用比色法测定总黄酮提取量，以芦丁浓度C为自变量、吸光值A为因变量，得到标准曲线方程：A=13.193C-

0.0013（R2=0.9985）。精确量取1.0 mL样品提取液，于510 nm处测定其吸光值，根据标准曲线方程计算样液中总黄酮提取量（王岚等，2014）。

1. 2. 2 提取工艺条件优化 选择影响七叶一枝花总黄酮提取的4个主要因素进行考察，分别以液料比[10∶1、15∶1、20∶1、25∶1和30∶1（mL/g）]、乙醇体积分数（15%、30%、45%、60%和75%）、微波功率（100、200、400、600和800 W）和微波时间（10、20、30、40和50 s）进行单因素试验，以确定各因素的最适水平。在此基础上进行响应面分析，以确定总黄酮最佳提取工艺条件（黄仁术等，2015）。每处理重复3次。

1. 3 统计分析

采用Excel 2003对单因素试验结果进行处理并制图，采用Design-Expert 9.0.3构建多元二次回归模拟方程及进行方差分析。

2 结果与分析

2. 1 单因素试验结果

2. 1. 1 最适液料比的选择 由图1可知，在固定乙醇体积分数40%、微波功率400 W、微波时间30 s的条件下，七叶一枝花总黄酮提取量随着液料比的增大呈先升高后降低的变化趋势；当液料比为15∶1时，总黄酮提取量最高，为4.07 mg/g。因此，确定提取七叶一枝花总黄酮的最适液料比为15∶1。

2. 1. 2 最适乙醇体积分数的选择 由图2可知，乙醇体积分数的变化对七叶一枝花总黄酮提取量有明显影响。在固定液料比15∶1、微波功率400 W、微波时间30 s的条件下，随着提取液乙醇体积分数的增加，总黄酮提取量呈先升后降的变化趋势，当乙醇体积分数为45%时浸提效果最佳。因此，确定提取七叶一枝花总黄酮的最适乙醇体积分数为45%。

2. 1. 3 微波功率的选择 由图3可知，在固定乙醇体积分数45%、液料比15∶1、微波时间30 s的条件下，七叶一枝花总黄酮提取量随微波功率的增加也呈先升高后降低的变化趋势；当微波功率为400 W时，总黄酮提取量达最大值（4.76 mg/g）。虽然增加微波功率有利于总黄酮的提取，但过大会对有机物质造成破坏。因此，确定提取七叶一枝花总黄酮的最适微波功率为400 W。

2. 1. 4 微波时间的选择 由图4可知，在固定乙醇体积分数45%、液料比15∶1、微波功率400 W的条件下，七叶一枝花总黄酮提取量随微波时间的延长呈先逐渐升高后略有下降的变化趋势。微波时间为40 s的总黄酮提取量最高，为4.57 mg/g。虽然延长微波时间可使有机物质提取得更彻底，但过长的处理时间也会造成部分提取物分解，且有可能增加其他杂质的浸出，从而影响最终的提取效果。因此，确定提取七叶一枝花总黄酮的最适微波时间为40 s。

2. 2 响应面试验结果

2. 2. 1 Box-Behnken试验设计 根据单因素试验方差分析结果（表1），选取影响七叶一枝花总黄酮提取量的3个关键因素（乙醇体积分数、液料比、微波功率）进一步研究。根据Box-Behnken中心组合试验设计原理，设计3因素3水平的响应面分析试验，探索最佳提取条件及因素间的交互作用，以获得七叶一枝花总黄酮提取的最佳工艺参数。试验因素及水平设计见表2。

2. 2. 2 回归模型的建立和显著性检验 利用Design-Expert 9.0.3对试验结果（表2）进行回归分析，各因素经回归拟合后，得到七叶一枝花总黄酮提取量（Y）与各提取因素变量的多元二次回归方程：Y=4.90+

0.30A+0.51B+0.48C-0.19AB+0.44AC+0.24BC-0.85A2-0.83B2-0.55C2。

由表3可知，以七叶一枝花总黄酮提取量为响应值时，回归模型P<0.01，表明该模型具有高度显著性；失拟项P>0.05，说明模型中试验误差较小，即未知因素的干扰性很小。同时模型中R2=0.9734，说明其拟合程度较高，能够用于指导七叶一枝花总黄酮提取试验设计。

由表3还可知，该模型中一次项A、B、C的P<0.01，说明乙醇体积分数、液料比和微波功率对七叶一枝花总黄酮提取效果影响极显著（P<0.01，下同）；交互项AC的P=0.0067<0.01，即乙醇体积分数与微波功率的交互作用对七叶一枝花总黄酮提取效果也有极显著影响，但乙醇体积分数与液料比、液料比与微波功率的交互作用对总黄酮提取无显著影响（P>0.05）。

2. 2. 3 响应面分析 采用Design-Expert 9.0.3对3个主要因素间的交互作用进行分析，以确定其对总黄酮提取量的影响，并绘制两因素间的交互作用对七叶一枝花总黄酮提取量影响的响应曲面图。由图5可看出，在相同乙醇体积分数条件下，七叶一枝花总黄酮提取量随液料比的增大呈先升高后降低的变化趋势；在相同液料比条件下，随着乙醇体积分数增大，总黄酮提取量呈升高趋势。由图6可知，在相同液料比条件下，随着微波功率的增大，总黄酮提取量先升高后降低；在相同微波功率条件下，总黄酮提取量则随液料比的增大呈升高趋势。由图7可看出，在相同微波功率条件下，随着乙醇体积分数的增大，总黄酮提取量先升高后降低；在相同乙醇体积分数条件下，总黄酮提取量随微波功率的增大呈升高趋势。

2. 2. 4 最佳提取条件的确定及验证 通过对回归拟合方程和回归模型分析，得到七叶一枝花总黄酮最佳提取条件：乙醇体积分数49.63%、液料比17.24∶1、微波功率528.08 W，总黄酮提取量预测值为5.18 mg/g。为检验响应面试验设计的可靠性，结合实际生产操作便利性等因素，将最优参数修正为：乙醇体积分数50%、液料比17∶1、微波功率528 W，在此条件下对总黄酮提取工艺模型进行3次验证试验，得到总黄酮提取量为5.28 mg/g，其相對误差为1.93%，即证明该模型预测的准确性和可行性。

3 讨论

植物总黄酮的提取方法较多，包括水提法、醇提法、酶法、超声波法、微波法、大孔树脂吸附分离法和超临界CO2流体萃取法等。每种方法各有特点，其中微波辅助提取法具有提取效率高、适用范围广等优势（李学坤等，2014；黄仁术等，2015）。本研究以总黄酮提取量为指标，利用微波辅助法进行醇提，在最佳工艺条件下得到七叶一枝花总黄酮提取量为5.28 mg/g，与超声波辅助法（王岚等，2014）相比，所需的乙醇体积分数更小，提取量更大，提取效率更高。

相比于正交设计而言，响应面法不仅能在更大范围内筛选出合适的试验水平组合，还能分析试验因素对指标交互作用的影响（喻俊等，2015）。本研究通过单因素试验筛选出影响七叶一枝花总黄酮提取量的关键因素及最适水平，在此基础上，利用Design-Expert 9.0.3进行试验设计和响应面分析，建立了乙醇体积分数、液料比和微波功率3个关键因素与七叶一枝花总黄酮提取量之间的数学模型，优化得到3个关键因素最适参数：乙醇体积分数50%、液料比17∶1、微波功率528 W，并证明乙醇体积分数与微波功率间的交互作用对七叶一枝花总黄酮提取量有极显著影响。响应面法获得的试验结果较正交试验选取的因素水平范围更广，操作性更强。

响应面分析中关键因素及水平的确定，需参考Plackett-Burman试验及最陡爬坡法的结果（梁昌聪等，2014）；而本研究中关键因素及水平的确定依据单因素试验结果，两者间的结论是否一致，还需进一步验证。同时，响应面分析获得的最适微波功率与单因素试验确定的最佳功率相差较大，是否因多因素交互作用所致尚需进一步研究。

4 结论

本研究在单因素试验的基础上进行响应面分析，建立的3个关键因素与七叶一枝花总黄酮提取量间的数学模型回归效果显著；优化得到的微波辅助提取工艺参数为乙醇体积分数50%、液料比17∶1、微波功率528 W，在此条件下得到总黄酮提取量为5.28 mg/g，与理论值基本吻合，即优化的工艺参数具有一定的可行性，可用于实际生产。

参考文献：

陈婵，丁玲，彭宏，林叶，郑敬森. 2015. 不同方法提取柚皮总黄酮含量的比较研究[J]. 江西农业学报，27（6）：75-78.

Chen C，Ding L，Peng H，Lin Y，Zheng J S. 2015. Comparative study on content of total flavonoids extracted from shaddock peel by using different methods[J]. Acta Agriculturae Jiangxi，27（6）：75-78.

黄仁术，胡晓梦，何惠利. 2015. 大别山野葛根异黄酮超声辅助提取工艺的响应面优化与还原力测定[J]. 中国药学杂志，50（1）：51-57.

Huang R S，Hu X M，He H L. 2015. Optimization of ultrasonic-assisted extraction techniques of isoflavones from Pueraria lobata（Wild） Ohwi in Dabie mountain by response surface methodology and reducing power measurement[J]. Chinese Pharmaceutical Journal，50（1）：51-57.

蒋华梅，石登红. 2015. 拟覆盆子叶总黄酮提取及抗氧化活性[J]. 貴州农业科学，43（11）：169-173.

Jiang H M，Shi D H. 2015. Extraction and antioxidant activity of total flavonoids from Rubus idaeopsis Focke leaves[J]. Guizhou Agricultural Sciences，43（11）：169-173.

李焘. 2011. 滇重楼与七叶一枝花化学成分及生物活性的研究[D]. 西安：陕西师范大学.

Li T. 2011. Chemical components and biological activity of Paris polyphylla Smith var. yunnanensis （Franch.） Hand-Mazz. and Paris polyphylla Smith var. chinensis（Franch.） Hara[D]. Xian：Shaanxi Normal University.

李学坤，李莉，田盼盼，刘明霞，李稳宏. 2014. 响应面法优化微波辅助蜗牛酶提取女贞子黄酮[J]. 化学工程，42（3）：6-10.

Li X K，Li L，Tian P P，Liu M X，Li W H. 2014. Optimization for microwave and snailase assisted extraction process of fla-

vonoid compounds from glossy privet fruit by responsive surfaces methodology[J]. Chemical Engineering，42（3）：6-10.

李于善，周强，张玉针，黄春迎. 2009. 三峡七叶一枝花薯蓣皂苷元的分离提取工艺研究[J]. 化学世界，50（2）：86-89.

Li Y S，Zhou Q，Zhang Y Z，Huang C Y. 2009. Studies on the extraction process of diosgenin from Paris polyphylla from China Three Gorges[J]. Chemical World，50（2）：86-89.

梁昌聪，刘磊，张建华，郭立佳，王伟伟，黄俊生. 2014. 响应面法优化绿色木霉H06产孢发酵培养基[J]. 热带作物学报，35（2）：333-338.

Liang C C，Liu L，Zhang J H，Guo L J，Wang W W，Huang J S. 2014. Optimization of medium components for sporulation quantity by Trichoderma viride strain H06 using response surface methodology[J]. Chinese Journal of Tropical Crops，35（2）：333-338.

童立雷. 2012. 重楼总皂苷提取工艺及抗氧化特性[D]. 合肥：安徽农业大学.

Tong L L. 2012. Total saponin extraction from Paris polyphylla and its antioxidant activities[D]. Hefei：Anhui Agricultural University.

王岚，陈仕学，姚元勇. 2013. 梵净山七叶一枝花总黄酮含量测定[J]. 安徽农学通报，19（20）：25-26.

Wang L，Chen S X，Yao Y Y. 2013. Determination for total flavones quantity in the Paris polyphylla in Fanjing Mountain[J]. Anhui Agricultural Science Bulletin，19（20）：25-26.

王岚，吴定军，鲁道旺. 2014. 梵净山七叶一枝花总黄酮提取工艺的优化[J]. 南方农业学报，45（4）：634-638.

Wang L，Wu D J，Lu D W. 2014. Optimization on extraction of total flavonoids from Paris polyphylla in Fanjing Mountain[J]. Journal of Southern Agriculture，45（4）：634-638.

杨忠飞，赵成刚. 2015. 微波提取金果榄总黄酮的工艺及其抗氧化性[J]. 贵州农业科学，43（4）：187-190.

Yang Z F，Zhao C G. 2015. Extraction technology and antioxidant activity of total flavones extracted from Radix tinosporae by microwave method[J]. Guizhou Agricultural Sciences，43（4）：187-190.

喻俊，王涛，贾春红，孙继业，胡尚钦，张利. 2015. 响应面优化牛蒡子多糖的提取及其抗氧化活性研究[J]. 食品与发酵工业，41（6）：207-212.

Yu J，Wang T，Jia C H，Sun J Y，Hu S Q，Zhang L. 2015. Response surface methodology for optimization extraction and antioxidant activities study of polysaccharides from Fructus arctii[J]. Food and Fermentation Industries，41（6）：207-212.

喻祖文，劉颖新，李辉，李飞艳. 2013. 微波法提取重楼总皂苷的工艺研究[J]. 时珍国医国药，24（4）：833-834.

Yu Z W，Liu Y X，Li H，Li F Y. 2013. Microwave-assisted extraction technology of total saponins from Paris[J]. Lishizhen Medicine and Materia Medica Research，24（4）：833-834.

钟彦，周浓，杜思雯，郭冬琴. 2014. 四种重楼属植物中总黄酮含量的比较分析[J]. 湖北农业科学，53（6）：1420-1421.

Zhong Y，Zhou N，Du S W，Guo D Q. 2014. Comparison of total flavonoids in four Paris L. resources[J]. Hubei Agricultural Sciences，53（6）：1420-1421.

周浓，张玉莲，郭冬琴，张采琼，杨晓艳. 2014. 滇重楼总黄酮提取工艺的正交试验法优选[J]. 时珍国医国药，25（3）：581-583.

Zhou N，Zhang Y L，Guo D Q，Zhang C Q，Yang X Y. 2014. Study on extraction condition of total flavonoids from Paris polyphylla var. yunnanensis by orthogonal test method[J]. Lishizhen Medicine and Materia Medica Research，25（3）：581-583.

（责任编辑 罗 丽）