文马强　周小毛　刘佳　周勇　莫博程　朱哲远

摘要：【目的】測定直播水稻田千金子（Leptochloa chinensis （L） Nees.）对氰氟草酯的抗药性水平及氰氟草酯对千金子代谢酶和抗氧化酶的影响，为千金子的科学防治和抗性治理提供理论参考。【方法】采用整株植物测定法测定湖南省部分地区10个直播稻田千金子种群对氰氟草酯的抗药性水平，并比较千金子抗性和敏感种群间谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）及过氧化氢酶（CAT）活力的差异。【结果】以湄江千金子种群为敏感品系，其他千金子种群对氰氟草酯的抗性指数为1.2～11.0，其中衡阳茶山坳种群的抗性指数最高，达11.0。经75.000 g/ha氰氟草酯处理2 d后，抗性种群GSTs活力急剧上升，于药后3 d达最高值，之后急剧下降，5 d后趋于平缓；药剂处理1 d后，敏感种群GSTs活力急剧上升，在药后2 d达最高值，之后下降，敏感种群GSTs活力在3～7 d均低于同期抗性种群。经药剂处理后，抗性种群与敏感种群SOD、POD及CAT活力变化趋势基本一致，但抗性种群始终高于同期敏感种群。【结论】10个千金子种群中衡阳茶山坳种群对氰氟草酯的相对抗性水平最高，处于中等抗药性水平。千金子抗性种群对氰氟草酯产生抗性可能与GSTs、SOD、POD和CAT活力增强有关。

关键词： 千金子；氰氟草酯；抗药性；生化机理；湖南

中图分类号： S481.4 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）04-0647-06

Abstract：【Objective】In the present study，resistance of Leptochloa chinensis（L） Nees. to cyhalofop-butyl in rice field of direct seeding and influence of cyhalofop-butyl on L. chinensis（L） Nees. metabolic enzyme and antioxidase were studied， in order to provide reference for control and resistance management of L. chinensis（L） Nees. 【Method】Using whole-plant assay method， resistance levels of different L. chinensis（L） Nees. populations from ten rice fileds of direct seeding to cyhalofop-butyl were detected. The differences between resistant and susceptible L. chinensis（L） Nees. populations in activities of Glutathione s-transferase（GSTs）， superoxide dismutase（SOD）， peroxidase（POD） and catalase（CAT） were analyzed. 【Result】Results showed that Meijiang population was identified as susceptible population， the resistance index of other populations to cyhalofop-butyl was 1.2-11.0， and the highest resistance index was 11.0， which was found in Chashanao town， Hengyang. The activity of GSTs in resistant population increased sharply after 2 days of 75.000 g/ha cyhalofop-butyl treatment， reached the highest value after day 3， then decreased rapidly and became steady after day 5. One day after the treatment， the activity of GSTs in susceptible population increased sharply and reached the maximum on day 2， and then declined. The activity of GSTs in the susceptible population was lower than that of the resistant population during day 3-7. The variation trend of SOD， POD and CAT activities in resistant and susceptible populations was similar， but the values of resistant population was significantly higher than those of susceptible population. 【Conclusion】Among ten L. chinensis（L） Nees. populations， the resistance level of Chashanao population to cyhalofop-butyl was the highest， which is at a moderate level. The resistance of the resistant L. chinensis（L） Nees. population to cyhalofop-butyl may be related to the enhancement of GSTs， SOD， POD and CAT activities.

Key words： Leptochloa chinensis（L） Nees.； cyhalofop-butyl； resistance； biochemical mechanism； Hunan

0 引言

【研究意义】千金子[Leptochloa chinensis（L）Nees.]为一年生禾本科杂草，在我国主要分布于华东、华中、华南、西南及陕西等地。千金子具有成株率高、分蘖力强且对常用除草剂不敏感等特点，其在稻田中的危害日益严重（董立尧等，2003）。近年来，千金子在南方稻区迅速蔓延，已成为仅次于稗草（Echinochloa crusgalli Beauv）的直播稻田恶性杂草，在部分直播稻田的危害甚至超过稗草，对水稻生长和产量构成严重威胁（陆云梅等，2001；程勤海等，2011）。乙酰辅酶A羧化酶（ACCase）抑制剂是以乙酰辅酶A羧化酶为作用靶标的一类除草剂，多用于苗后一年生禾本科杂草防除。氰氟草酯（Cyhalofop-butyl）属ACCase抑制剂类除草剂，对千金子高效，但有研究表明千金子对氰氟草酯产生了抗药性（夏向东等，2013）。因此，研究直播稻田千金子对氰氟草酯产生抗性的机理机制，能为更好地防治直播稻田千金子提供科学依据。【前人研究进展】随着ACCase抑制剂类除草剂长期大量不合理使用，目前已有多种禾本科杂草对ACCase抑制剂类除草剂产生了不同程度的抗药性（Liu et al.，2007；Yu al.，2007；Petit et al.，2010）。Rahman等（2011）报道马来西亚稻田的千金子对氰氟草酯产生了抗药性，抗性指数为1.06倍，但未阐述抗性发生的原因。普遍认为，杂草对ACCase抑制剂类除草剂的抗性机制分为靶标抗性和非靶标抗性，靶标抗性由羧基转移酶结构域内单氨基酸改变引起，能影响ACCase抑制剂类除草剂的有效结合（Powles and Yu，2010）。Pornprom等（2006）报道泰国稻田的千金子对精噁唑禾草灵产生了抗性，且抗性指数在10～25倍，ACCase活性测定试验表明，抗性种群ACCase活力显著高于敏感种群，产生抗性的原因可能与靶标酶（ACCase）位点突变有关。有研究显示，ACCase的CT结构域中的色氨酸（Trp）-2027被半胱氨酸（Cys）取代是千金子对氰氟草酯产生抗性的原因之一（Yu et al.，2016）。由于多基因参与机制，非靶标抗性相对于靶标抗性可能会对农业构成更大威胁（Preston，2004）。谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）是杂草对除草剂产生非靶标抗性的关键酶，在一些作物和杂草中，GSTs能与一些除草剂结合促进代谢从而具有解毒作用（Edwards and Dixon，2000；Reade et al.，2004）。有研究表明，除草剂与GSTs结合后可在液泡中被消化（Martinoia et al.，1993），或通过根尖渗出（Schr■der，2007）。Bakkali等（2007）在抗性稗草中证明其对禾草灵的抗性可归因于GSTs与除草剂的结合从而增强除草剂的代谢作用。Cummins等（1999）对一些多抗大穗看麦娘（Alopecurus myosuroides Huds.）种群的研究表明，它们虽然具有被增强的P450酶系促进除草剂的代谢，但其GSTs活力更高，在这些种群中，活力升高的GSTs可能在促进除草剂代谢方面具有一定作用。植物体内的抗氧化酶系——超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）可减轻由于逆境胁迫给植物带来的伤害，而除草剂对于杂草来说正是一种非生物逆境。吴进才等（2002）研究发现，水稻叶鞘经除草剂处理5 d后其SOD活力开始上升，且在10 d左右达最高值，表明水稻植株内的SOD对除草剂所带来的伤害有一定的抵御作用。Pyon等（2004）的研究结果显示，抗氧化酶系活性的提高，可能是小飞蓬[Erigeron canadensis （L） Cronq.]对草甘膦产生抗性的原因之一。李浙江（2006）研究发现，抗精喹禾灵马唐[Digitaria sanguinalis（L） Scop.]种群中CAT活性显著高于敏感种群。有研究表明，用绿麦隆处理小麦植株，小麦根中总POD活性有显著提高（Song al.，2007）。经精喹禾灵处理的抗性稗草种群中POD活性也有明显提高（Huan et al.，2011）。【本研究切入点】目前，未见有关湖南省直播稻田千金子对氰氟草酯产生抗药性的报道，也鲜见通过氰氟草酯对千金子GSTs、SOD、POD和CAT活力的影响来揭示其抗性机理的研究。【拟解决的关键问题】对采自湖南省部分地区的直播稻田千金子种群，采用整株植物测定法明确千金子对氰氟草酯的抗药性水平，并通过施药后抗性及敏感千金子种群间GSTs、SOD、POD和CAT活力的变化，初步探讨千金子对氰氟草酯的抗性生化机理，为直播水稻田千金子的科学防治及抗性治理提供理论参考。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

1. 1. 1 供试种子 2015年10月，在湖南省部分使用氰氟草酯多年的直播水稻田中采集成熟的千金子种子，采集地点及氰氟草酯应用历史见表1。

1. 1. 2 试验设备 超干/低湿存储柜（明日拜傲科技有限公司），光照培养箱（杭州托普仪器有限公司），3WPSH-500D型生测喷雾塔（农业部南京农业机械化研究所），A560型紫外分光光度计（翱艺仪器有限公司），X-22R高速冷冻离心机（美国贝克曼库尔特有限公司），Multiskan FC酶标仪（赛默飞世尔仪器有限公司）。

1. 1. 3 试剂 10%氰氟草酯乳油（安徽美蘭农业发展股份有限公司），85%赤霉素A3结晶粉（湖南神隆超级稻丰产生化有限公司），无水乙醇（天津恒兴化学试剂有限公司）。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 供试植物培养 将壤土与营养土按照体积比2∶1混匀，装入直径9 cm、高8 cm的塑料盒中，塑料盒底部钻取一个直径0.5 cm的小孔，用清水将土壤完全浇透后，每盆播撒40粒左右的千金子种子（播种前种子用400 mg/L赤霉素溶液浸泡24 h），放入光照培养箱中培养。培养条件为白天32 ℃、14 h，夜晚25 ℃、10 h，每天补充适量清水。

1. 2. 2 千金子种群对氰氟草酯的抗性测定 采用整株植物测定法（王亚庆等，2002）测定：千金子生长至2～3叶期，间苗，每盆保留15株；3～4叶期再进行一次间苗，保留10株，进行喷药处理。有效成分氰氟草酯的用量设为：0（CK）、4.687、9.375、18.750、37.500、75.000和150.000 g/ha，每处理3次重复，21 d后剪取地上部分，称量鲜物质质量。

1. 2. 3 GSTs、SOD、POD和CAT活性测定 取湄江千金子种群为敏感（S）品系，衡阳茶山坳千金子种群为抗性（R）品系。于千金子4～5叶期，用75.000 g/ha氰氟草酯进行茎叶喷雾，设清水为对照（CK）。施药后1～7 d每天剪去千金子地上部分。称取千金子地上部分0.5 g，剪碎放入预冷的研钵中，加入4.5 mL 0.1 mol/L预冷的磷酸缓冲液（pH 7.4）冰浴匀浆，4000 r/min离心10 min，取上清液待测。蛋白质含量测定采用考马斯亮蓝G-250法，各酶活力测定方法参照南京建成生物工程研究所提供的试剂盒。GSTs、SOD、POD和CAT的相对活力为处理样品（施药）酶活力与对照样品（未施药）酶活力的比值。

1. 3 统计分析

试验数据采用SPSS 19.0处理，得出毒力回归方程y=a+bx计算氰氟草酯对千金子的抑制中剂量（GR50）；差异显著性采用Duncans新复极差法进行比较。

2 结果与分析

2. 1 千金子種群对氰氟草酯的抗性水平测定结果

如表2所示，氰氟草酯对MJ种群的GR50为6.506 g/ha，因此以MJ种群为相对敏感（S）种群作为对照，其他种群对氰氟草酯的相对抗性指数在1.2～11.0，其中CSA种群的相对抗性水平最高，其次为TZM、XS和QJZ种群。

由图2可知，经75.000 g/ha氰氟草酯处理后，抗性种群SOD活力于药后1 d升至对照的1.90倍；药后3 d达最高值，为对照的2.18倍；SOD活力在药后4、5 d下降后于药后6 d又继续上升至第二个峰值，是对照的1.68倍。敏感种群的SOD活力也在氰氟草酯处理后3 d达最高值，然后迅速下降至对照水平以下，其1～7 d的酶活力始终低于同期抗性种群。

由图3可知，经75.000 g/ha氰氟草酯处理后，抗性种群POD活力于药后1 d迅速上升至对照的1.33倍，并在药后3 d达最高值，是对照的1.53倍，之后开始下降。敏感种群POD活力于药后1 d开始下降，仅为对照的0.63倍，随即迅速上升，在药后3 d达最高值，为对照的1.26倍，然后开始下降；敏感种群在药后1、2、5、6和7 d的POD活力波动较大且均低于对照水平。

图4表明，经75.000 g/ha氰氟草酯处理，抗性种群的CAT活力迅速上升，在药后4 d达最高值，为对照的5.91倍，然后开始下降。敏感种群CAT活力则是缓慢上升，并在药后4 d达最高值，仅为对照的2.60倍，其活力始终低于抗性种群。

3 讨论

本研究采用整株植物测定法测定了湖南省部分地区的10个千金子种群对氰氟草酯的抗药性，其中衡阳茶山坳种群的相对抗药性水平最高，GR50为71.731 g/ha，以湄江种群为对照，衡阳茶山坳种群的相对抗性指数为11.0，处于中等抗药性水平，调查发现当地使用氰氟草酯防除稻田杂草已有8年，可能在长期的选择压下千金子对氰氟草酯产生了抗药性，因此在千金子防治过程中，应选用多种不同作用机理的除草剂并交替使用，以缓解千金子抗药性的发展。本研究针对湖南省部分地区直播水稻田千金子进行了抗药性水平测定，今后应进一步扩大疑似抗性千金子种群的采集区域。

本研究中抗性种群和敏感种群的GSTs活力存在一定差异，敏感种群的GSTs活力于药后2 d上升到最高值，抗性种群GSTs活力在药后3 d上升到最高值，且抗性种群GSTs活力高于敏感种群，推测千金子对氰氟草酯产生抗药性可能是GSTs对氰氟草酯代谢能力的提高。有研究报道，在一些黑麦草种群中GST酶系可能通过保护性黄酮类化合物对有害自由基产生抑制作用，从而使杂草具有抗药性（Cummins et al.，2013）。非靶标抗性（NTSR）近年来被越来越多的人认为是杂草对ACCase抑制类除草剂产生抗性的主要机制（Délye et al.，2011）。在一些案例中，NTSR所导致的抗性水平甚至超过了最典型的靶标抗性机制。Kaundun等（2013）发现一些大穗看麦娘种群对炔草酯（Clodinafop-propargyl）和草吡唑（Pinoxaden）的非靶标抗性水平远高于靶标位点突变所造成的靶标抗性水平。SOD是机体内天然存在的超氧自由基清除因子，能将超氧自由基转化为过氧化氢，尽管过氧化氢仍是对机体有害的活性氧，但体内的CAT和POD会立即将其分解为完全无害的水，因此，SOD、CAT和POD便组成了一个完整的防氧化链条（Fridovich，1977）。本研究中，经过氰氟草酯处理后千金子抗性和敏感种群的SOD活力同样出现上升现象，且均在药后3 d升至最高值；1～7 d期间，抗性种群的SOD活力始终高于敏感种群，而两个种群中的POD和CAT活力也出现了类似变化，可能是除草剂能够影响植株的活性氧代谢，而受到活性氧伤害的植株体内抗氧化系统应激清除活性氧，在一定程度上促进了以SOD为主导的一系列抗氧化酶的活性，从而达到保护植株的目的。

本研究仅从代谢酶及抗氧化酶方面初步探讨了千金子对氰氟草酯产生抗性的生化机理，但抗性的产生是否与其他酶系的表达、靶标酶基因突变有关还有待进一步探究。

4 结论

本研究结果表明，湖南省部分地区10个千金子种群中衡阳茶山坳种群对氰氟草酯的相对抗性水平最高，处于中等抗药性水平。千金子抗性种群对氰氟草酯产生抗性的原因可能与GSTs、SOD、POD及CAT活力增强有关。

参考文献：

程勤海，丰青，陆志杰，金周浩. 2011. 浙江省海宁市直播稻田千金子大发生原因及治理对策[J]. 杂草科学，29（2）：60-62.

Cheng Q H，Feng Q，Lu Z J，Jin Z H. 2011. Reasons analysis and prevention to Leptochloa chinensis outbreak of direct-seedling rice field in Haining city，Zhejiang province[J]. Weed Science， 29（2）：60-62.

董立尧，武淑文，高同春，周伯军，沈晋良. 2003. 千金子发生特点与危害及其防除研究进展[J]. 中国农学通报，19（1）：55-61.

Dong L Y，Wu S W，Gao T C，Zhou B J，Shen J L. 2003. Advances in the research on occurrence characteristics and damages of Leptochloa chinensis（L.） Nees. and its control[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin，19（1）：55-61.

李浙江. 2006.精喹禾灵抗性与选择性代谢机理的初步研究[D]. 泰安：山东农业大学.

Li Z J. 2006. Preliminary studies on resistance measure and selectivity metabolize mechanism of Quizalof-p-ethyl[D]. Taian：Shandong Agricultural University.

陆云梅，傅华欣，顾文，朱龙粉，毛华方，吴科军. 2001. 水稻田千金子发生危害与防除对策[J]. 杂草科学， 19（1）：9-10.

Lu Y M，Fu H X，Gu W，Zhu L F，Mao H F，Wu K J. 2001. Damage of Leptochloa chinensis in rice fields and its strategy for control[J]. Weed Science， 19（1）：9-10.

吴进才，刘井兰，沈迎春，徐建祥，姜永厚，徐素霞. 2002. 农药对不同水稻品种SOD活性的影响[J]. 中国农业科学，35（4）：451-456.

Wu J C，Liu J L，Shen Y C，Xu J X，Jiang Y H，Xu S X. 2002. Effect of several pesticides on SOD activity in different rice varieties[J]. Scientia Agricultura Sinica，35（4）：451-456.

王慶亚，董立尧，娄远来，张守栋. 2002. 农田杂草抗药性及其检测鉴定方法[J]. 杂草科学，20（2）：1-5.

Wang Q Y，Dong L Y，Lou Y L，Zhang S D. 2002. Review on the herbicide resistance of weeds in crop and its checking and determining methods[J]. Weed Science，20（2）：1-5.

夏向东，马洪菊，许孟涵，臧振娟，李建洪. 2013. 杂草对芳氧苯氧丙酸类（APPs）除草剂的抗性分子机理研究进展[J].农药学学报，15（6）：609-614.

Xia X D，Ma H J，Xu M H，Zang Z J，Li J H. 2013. Research progress on molecular mechanism of resistant weeds to aryloxyphenoxypropionate herbicides[J]. Chinese Journal of Pesticide Science，15（6）：609-614.

Bakkali Y，Ruiz-Santaella J P，Osuna M D，Wagner J，Fischer A J，de Prado R. 2007. Late watergrass（Echinochloa phyllopogon）： Mechanisms involved in the resistance to fenoxapropp-

ethyl[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，55（10）：4052-4058.

Cummins I，Cole D J，Edwards R. 1999. A role for glutathione transferases functioning as glutathione peroxidases in resistance to multiple herbicides in black-grass[J]. Plant Journal，18（3）：285-292.

Cummins I，Wortley D J，Sabbadin F，He Z，Coxon C R，Straker H E，Sellars J D，Knight K，Edwards L，Hughes D，Kaundun S S，Hutchings S J，Steel P G，Edwards R. 2013. Key role for a glutathione transferase in multiple-herbicide resistance in grass weeds[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences，110（15）：5812-5817.

Délye C，Gardin J A C，Boucansaud K，Chauvel B，Petit C. 2011. Non-target-site-based resistance should be the centre of attention for herbicide resistance research： Alopecurus myo-

suroides as an illustration[J]. Weed Research，51（5）：433-437.

Edwards R，Dixon D P. 2000. The role of glutathione transferases in herbicide metabolism[J]. Herbicides and their mechanisms of action，8：38-71.

Fridovich I. 1997. Oxygen is toxic！[J]. Bioscience，27（7）：462-466.

Huan Z B， Zhang H J， Hou Z， Zhang S Y， Zhang Y， Liu W T. 2011. Resistance level and metabolism of barnyard-grass （Echinochloa crusgalli （L.） beauv.） populations to quizalofop-p-ethyl in Heilongjiang province，China[J]. Journal of Integrative Agriculture，10（12）：1914-1922.

Kaundun S S，Hutchings S J，Dale R P，McIndoe E. 2013. Role of a novel I1781T mutation and other mechanisms in conferring resistance to Acetyl-CoA carboxylase inhibiting herbicides in a black-grass population[J]. PloS One，8（7）：e69568.

Liu W，Harrison D K，Chalupska D，Gornicki P，ODonnell C C，Adkins S W，Haselkorn R，Williams R R. 2007. Single-site mutations in the carboxyl transferase domain of plastid acetyl-CoA carboxylase confer resistance to grass-specific herbicides[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，104（9）：3627-3632.

Martinoia E，Grill E，Tommasini R，Kreuz K，Amrhein N. 1993. ATP-dependent glutathione S-conjugate ‘export pump in the vacuolar membrane of plants[J]. Nature，364（6434）：247-249.

Petit C，Bay G，Perin F，Delye C. 2010. Prevalence of cross or multiple resistance to the acetyl-coenzyme A carboxylase inhibitors fenoxaprop， clodinafop and pinoxaden in black-grass（Alopecurus myosuroides Huds.） in France[J]. Pest Management Science，66（2）：168-177.

Powles S B，Yu Q. 2010. Evolution in action： Plants resistant to herbicides[J]. Plant Biology，61：317-347.

Pornprom T， Mahatamnuchoke P， Usui K. 2006. The role of altered acetyl-CoA carboxylase in conferring resistance to fenoxaprop-P-ethyl in Chinese sprangletop（Leptochloa chinensis（L.） Nees）[J]. Pest Management Science， 62（11）：1109-1115.

Preston C. 2004. Herbicide resistance in weeds endowed by enhanced detoxification： Complications for management[J]. Weed Science，52（3）：448-453.

Pyon J Y， Ren Z P， Roh S W. 2004. Differential levels of antioxi-

dants in paraquat-resistant and-susceptible Erigeron cana-

densis， biotypes in Korea[J]. Weed Biology & Management， 4（2）：75-80.

Rahman M M， Ismail S， Sofian-Azirun M. 2011. Identification of resistant biotypes of Leptochloa chinensis in rice field and their control with herbicides[J]. African Journal of Biotechnology， 10（15）：2904-2914.

Reade J P H，Milner L J，Cobb A H. 2004. A role for glutathione S-transferases in resistance to herbicides in grasses[J]. Weed Science，52（3）：468-474.

Schr■der P. 2007. How plants cope with foreign compounds. Trans-

location of xenobiotic glutathione conjugates in roots of barley（Hordeumvulgare）（9 pp）[J]. Environmental Science and Pollution Research，14（2）：114-122.

Song N H， Yin X L， Chen G F， Yang H. 2007. Biological responses of wheat（Triticum aestivum） plants to the herbicide chlorotoluron in soils[J]. Chemosphere， 68（9）：1779-1787.

Yu J， Gao H T， Pan L， Yao Z W， Dong L Y. 2016. Mechanism of resistance to cyhalofop-butyl in Chinese sprangletop（Leptochloa chinensis（L.） Nees）[J/OL]. Pesticide Bioche-

mistry and Physiology[2016-12-12]. http：//dx.doi.org/10.

1016/j.pestbp.2016.11.001.

Yu Q，Collavo A，Zheng M Q，Owen M，Sattin M，Powles S B. 2007. Diversity of acetylcoenzyme A carboxylase mutations in resistant Lolium populations： Evaluation using clethodim[J]. Plant Physiol，145（2）：547-558.

（責任编辑 麻小燕）