吴林菁 冯华 吴红梅 汤容容 王祥培

摘要： 酢浆草（Oxalis corniculata）为酢浆草科植物，资源分布广泛，全草均可入药。该研究为建立酢浆草超高效液相色谱指纹图谱，采用乙腈-0.05%醋酸水溶液梯度洗脱，以Agilent ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18（2.1 mm × 100 mm，1.8 μm）色谱柱，流速0.3 mL·min1，进样量为10 μL，检测波长280 nm，柱温25 ℃等色谱条件，研究了15个不同产地30批酢浆草药材的指纹图谱。结果表明：确立了24个共有峰，相似度评价软件计算30批样品的相似度为0.839～0.987；应用聚类分析对各样品指纹图谱的共有峰峰面积统计分析得出，除贵州剑河、贵州印江及贵州天柱8月3批样品外，其余27批样品共有化学成分的含量较为接近。该研究结果表明建立的酢浆草UPLC指纹图谱方法简便、迅速、可靠，较其HPLC指纹图谱有更高的灵敏度和分辨率，极大地缩短了检测时间，可用于酢浆草质量评价的快速分析。

关键词： 酢浆草， 超高效液相色谱， 指纹图谱，聚类分析， 质量评价

中图分类号： Q946， R282.5文献标识码： A文章编号： 10003142（2017）09119509

Abstract： In order to establish fingerprint analysis by UPLC for the quality control of Oxalis corniculata， and to provide comprehensive evaluation of their quality in different regions， the fingerprint of O. corniculata was established by UPLC. The similarity evaluation and cluster analysis were used to deal with the experimental data， in order to find out the similarities and differences among the 30 batches of O. corniculata from 15 different areas. The specific chromatogram of O. corniculata was obtained， and 24 common peaks were identified. Similarities of the 30 batches of samples were 0.839-0.987. The results of cluster analysis were the 27 batches of samples content of chemical components were closer， in addition to samples of Jianhe County， Yinjiang County of Guizhou Province and Tianzhu County of Guizhou Province in August. The establishment of UPLC fingerprint of O. corniculata can provide a more comprehensive and faster reference for the quality control of Oxalis. This method is simple， rapid and reliable. It has higher sensitivity and resolution than HPLC and greatly shortens the detection time.

Key words： Oxalis corniculata， UPLC， fingerprint， cluster analysis， quality evaluation

酢漿草（Oxalis corniculata）广布于世界各地，在我国主要分布于华北、华中、华南、贵州、云南和四川等地（国家中医药管理局中华本草编委会，1999）。酢浆草主要含黄酮类、有机酸类、酯类等成分，全草均可入药，具有清热解毒、平肝定惊、消炎止痛等功效（贵州省药品监督管理局，2003；王海生等，2011；刘受先等，2011）。有文献报道酢浆草具有保护肝损伤（陈应康等，2015；Sreejth et al，2014）、降血脂（马鸿军等，2010）、抗焦虑（Sai et al，2011）及抗炎镇痛（崔珺等，2015，2016）等药理作用。由于我国是一个多地形、多气候、生态环境差异较大的国家，尤其是西南地区，特殊的地理环境及气候，对于资源分布广泛的酢浆草的药效是否会造成一定的影响，不同生境条件下的酢浆草质量差异是否明显，都是一个值得探讨的问题。前期研究已发现鲜品酢浆草的横切面显微特征可作为鲜品酢浆草的显微鉴别依据，但将其粉末显微特征作为鉴别依据还值得商榷（吴林菁等，2013）。课题组已建立了10批贵州产酢浆草药材及其混淆品的HPLC指纹图谱（冯华等，2014）。但是，由于其分析时间过长、耗能高、分离效率较低，且样品量较少，未能较为全面的表征分布广泛的酢浆草药材成分。因此，仅通过HPLC的指纹图谱研究结果来判定药材化学成分的整体性还不够科学合理，还需借助更为快速、准确的研究方法对酢浆草质量进行综合评价（刘幼娴等，2014；高青等，2016）。

超高效液相色谱指纹图谱（ultra performance liquid chromatography，UPLC），是一种以超细色谱柱填料为核心的新型色谱分离分析技术，相较于常规HPLC，UPLC具有更好的检测分析效果（刘国雄等，2017；周新等，2008；曾慧婷等，2017）。因此，为了更为全面的表征酢浆草药材成分，探索资源分布广泛的酢浆草药材专属性的指纹图谱特征，本研究建立了15个不同产地30批酢浆草药材的UPLC指纹图谱测定方法，为酢浆草的快速、准确质量评价提供参考依据，也为今后酢浆草的开发利用奠定基础。

1材料与方法

1.1 仪器、试剂与材料

Agilent1290型超高效液相色谱仪（美国Agilent公司），KQ500DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），AG135型电子天平（瑞士MettlerToledo公司）。甲醇为分析纯（天津科密欧试剂公司），乙腈为色谱纯（美国天地试剂公司），水为娃哈哈纯净水。酢浆草药材主要采自贵州及其他省份，所有材料经贵阳中医学院王祥培教授鉴定确定为酢浆草科酢浆草（Oxalis corniculata）植物。具体产地见表1。

1.2 色谱条件

采用Agilent ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18（1.8 μm，2.1 mm × 100 mm）色谱柱；以乙腈（A）-0.05%醋酸水溶液（B）为流动相。梯度洗脱程序如下：0～2.5 min，95%～83% B；2.5～6 min，83%～78% B；6～8 min，78%～76% B；8～10 min，76%～74% B；10～13 min，74%～63% B；13～18 min，63%～29% B；18～21 min，29%～0% B。检测波长为280 nm，柱温为25 ℃，流速为0.3 mL·min1，进样量为2 μL。

1.3 制备供试品溶液

精确称取酢浆草粉末1 g（过6号筛），加入乙醇50 mL，超声提取3次，第1、第2次每次提取30 min，第3次为20 min，滤过，取续滤液，合并，水浴蒸干，用乙醇溶解残渣并定容至10 mL，用0.22 μm微孔滤膜过滤，取滤液即得供试品溶液。

1.4 方法学考察

1.4.1 精密度取产地为北京的酢浆草（S1号）供试品溶液，按 “1.2色谱条件”连续进样6次，以共有色谱峰（15号）为参比峰，分别计算共有色谱峰的相对保留时间及相对峰面积。考察结果：各共有峰的相对峰面积RSD及相对保留时间均<3%，符合指纹图谱的要求，表明UPLC仪器精密度良好。

1.4.2 重复性取S8号（贵州都匀）药材，制备供试品溶液6份，按 “1.2色谱条件”进行测定，以共有色谱峰（15号）为参比峰，分别计算共有色谱峰的相对保留时间和相对峰面积。考察结果表明各共有峰的相对保留时间及相对峰面积RSD均<2%，表明该方法重复性良好，适用于酢浆草UPLC指纹图谱的分析。

1.4.3 稳定性取S25号（贵州六枝）供试品，按照“1.2色谱条件”分别在0、1、2、6、12、24 h进样测定，以共有色谱峰（15号）为参比峰，分别计算共有色谱峰的相对保留时间和相对峰面积。考察结果显示各共有峰的相对保留时间和相对峰面积RSD均<3%，说明符合指纹图谱的要求。这表明所制备的供试品溶液在24 h内稳定。

2结果与分析

2.1 指纹图谱的建立

取30批酢浆草供试样品，按照“1.3”的方法制备供试样品溶液，在“1.2”的色谱条件下分别进行样品检测，并记录UPLC色谱图。将30批酢浆草药材的UPLC图谱以AIA格式依次导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A版）软件中，参照S1号样品的图谱，设定时间漂移值为0.1，用中位数法自动匹配谱峰，生成对照指纹图谱。叠加图谱及对照图谱如图1所示。在各批次样品的图谱中，选择峰位相对居中，峰面积较大，且所有样品共有的15号色谱峰为参比峰，以其保留时间为1，标定了24个共有指纹峰，并对各共有色谱指纹峰的相對保留时间及相对峰面积进行计算，结果RSD值均<3.0%，符合指纹图谱的分析要求。如表2、表3所示。

2.2 相似度评价

设定对照图谱相似度为1，计算得出各样品UPLC图谱的相似度（表1）。 15个产地30批酢浆草样品的相似度为0.839～0.987，表明本研究各批次酢浆草样品的质量相对稳定，叠加UPLC特征图谱（图1）表明：不同产地的酢浆草化学成分基本一致，但在量上各成分却存在一定差异。根据相似度计算结果得出，样品 S30（产地贵州印江）相似度较低，其余14个产地29批样品相似度则较高（相似度>0.9）。

2.3 聚类分析

聚类分析是一种探索性的数据分析手段，目前已广泛应用于中药鉴别、质量评价和品种分类等方面的统计分析（徐锋等，2013）。

指纹图谱的共有色谱峰代表的是不同样品所含有的相同化学成分，其峰面积即为共有化学成分的含量。本研究采用聚类分析的组间连接法，样品间距离的计算方法为余弦距离，以各样品共有峰的峰面积为变量，导入SPSS20.0软件对15个不同产地、不同海拔的30批酢浆草样品进行系统聚类分析，比较不同产地共有化学成分的含量是否存在差异。聚类结果见图2。

当判别条件距离为20时，系统将30批酢浆草样品分为两类，S2、S5、S30三批样品被归为一类，其余27批样品聚为一类。其中，S2（产地贵州天柱）、S5（产地贵州剑河）、S30（产地贵州印江）的相似度依次为0.901、0.964、0.839， S2与S30较为接近且均较低，而S5的相似度较高。从采收时间看，S2与其同产地（贵州天柱）10月采收的样品S3并未归在同一类，从采收地点看S5与其同产地（贵州剑河）样品S4、S6也未归在同一类。综上结果表明，贵州天柱产酢浆草受其采收时间的影响，其共有化学成分的含量会产生一定波动；而贵州剑河产酢浆草的共有化学成分含量与其产地未呈现一定规律性；该文中其他产地样品共有化学成分具有很好的相似性，且含量较为接近。

3讨论与结论

3.1 提取方法的考察

本研究首先考察了供试品的制备方法，分别对甲醇、70%甲醇、乙醇、70%乙醇四种提取溶剂进行了考察，结果以乙醇提取的样品溶液图谱出峰信息量较大，且基线较为平稳。其次考察了回流和超声提取两种提取方式，结果两种提取方式的UPLC色谱图差异不明显，但考虑回流提取较为繁琐，耗时较长，最终确定超声方法进行提取；同时还考察了超声提取30 min（超声1次）、80 min（超声3次，第1、第2次每次为30 min，第3次20 min）、120 min（超声4次，每次30 min）三个提取提取时间，结果以超声提取80 min（超声3次，第1、第2次每次为30 min，第3次20 min）的图谱信息量较丰富、提取较完全。

3.2 色谱条件的优化

本研究考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.05%醋酸三种流动相体系，结果以乙腈-0.05%醋酸体系的色谱峰较多，且峰形和分离度效果都较好。比较了两种超高效液相色谱柱Agilent ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18（2.1 mm × 50 mm，1.8 μm）和Agilent ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18（2.1 mm × 100 mm， 1.8 μm）的色谱图，结果显示Agilent ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18（2.1 mm × 100 mm，1.8 μm）色谱柱的分离度和峰形效果较好，图谱基线较平稳。考察柱温分别为20、25、30、35 ℃时对色谱峰分离度的影响，结果在柱温25 ℃时分离度效果较好。比较流速0.1、0.15、0.2、0.3、0.5 mL·min1对色谱图峰形的影响，结果以流速0.3 mL·min1的色谱图峰形对称。对210、230、254、280、310、360 nm不同波长进行考察，发现在280 nm下图谱的信息较为全面，各色谱峰响应值较高，基线较为平稳，故选择280 nm作为检测波长。

3.3 酢浆草指纹图谱评价

影响药材质量的因素主要包括生态环境、采集时间、生长年限、加工方法和药用部位的选择以及指标性成分或有效成分的含量、贮藏、包装、运输等。由于生态环境和采收时期等的变化，其化学成分常处于一种动态变化中，所以药材质量的影响因素和复杂性增加。目前已有文献报道不同产地酢浆草的刺槐素6CβD葡萄糖苷含量差异较大（刘受先等，2011），但仅以单一化学成分尚不足以说明化学成分复杂的酢浆草的内部品质，同时所测定的酢浆草药材的产地应更为广泛和具体，以利于为综合评价资源分布广泛的酢浆草质量提供更为可靠的科学依据。本研究首次建立了酢浆草UPLC指纹图谱，与HPLC指纹图谱相比较，UPLC的分析时间明显缩短，流动相的消耗减少，而且灵敏度高、分离效率好。相似度评价分析结果显示，不同产地、不同海拔的酢浆草指纹图谱相似度除贵州印江产的样品S30为0.839，其余29批产地均在0.900以上，说明除贵州印江产地外，其余14个产地间的化学成分具有很好的相似性。共有峰峰面积的聚类分析结果表明，15个不同产地、不同海拔酢浆草药材共有化学成分的含量不具有一定的生态环境及海拔规律性，并初步说明酢浆草生长适应能力较强，其化学成分受地域环境差异的影响较小，但为保证酢浆草药材质量，必须规范其适宜产地及采收期，关于酢浆草药材质量与其生态环境及采收时间的相关性还有待进一步深入研究论证。本研究为全面评价酢浆草药材质量提供了更为高效、快速、灵敏且节能环保的检测方法。

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