冼康华 付传明 何金祥 龚庆芳 苏江 黄宁珍

摘要： 该研究以含有GFP和GUS基因的质粒和农杆菌为载体，采用花粉管通道法对铁皮石斛进行转基因技术研究。结果表明：（1）铁皮石斛种子萌发和原球茎生长对卡那霉素的最低致死浓度分别为90和150 mg·L1。进一步研究证实，在筛选转化种子和原球茎时，可分别向培养基中添加100和150 mg·L1的卡那霉素进行选择培养。（2）以携带GFP和GUS基因的质粒（pSuper1300和pBI121）和农杆菌为载体，用无菌去离子水重悬质粒pSuper1300和pBI121至浓度为100 ng·μL1，用2%蔗糖+1/2MS+0.1% silwet77+0.1% AS或5%蔗糖+0.1% silwet77+0.1 mmol·L1 AS重悬携带质粒pSuper1300和pBI121的农杆菌至菌液浓度为OD600=0.7～0.8；在授粉后0.5～2.5 h内使用柱头滴加法导入携带外源基因的质粒或农杆菌溶液，收集成熟的转化种子，经选择培养及PCR检测发现，几乎所有处理的转化材料均能检测出外源GFP和GUS基因片段。另外，与农杆菌相比，以质粒为载体进行转化，可获得更高的结实率。该研究结果为铁皮石斛的基因工程育种提供了参考。

关键词： 铁皮石斛， 花粉管通道法， 质粒， 农杆菌， 转基因

中图分类号： Q943.2， Q785文献标识码： A文章编号： 10003142（2017）09110110

Abstract： The transgenic technology of Dendrobium officinale was studied by using pollentube pathway with plasmid and agrobacterium vectors as target genes delivery. The main results were summarized as follows： （1） The minimum lethal concentration of kanamycin to seed germination and protocorm growth were 90 and 150 mg·L1 respectively. Further study showed that 100 and 150 mg·L1 kanamycin could be added for selecting transgenic seeds and protocorms during selective culture in vitro respectively. （2） Plasmid and agrobacterium contained GFP or GUS gene was transferred into D. officinale via pollentube pathway. The technology and method were summarized as follows： Collected target plasmid （pSuper1300 and pBI121） and agrobacterium which contained GFP or GUS gene； resuspended the plasmid pSuper1300 and pBI121 to concentration of 100 ng·μL1 with thrice distilled water， while resuspended the agrobacteria which carried plasmid pSuper1300 and pBI121 to OD600=0.7-0.8 with the solution of 2% sucrose+1/2MS+0.1% silwet77+0.1% AS or 5% sucrose+0.1% silwet77+0.1 mmol·L1 AS respectively； during 0.5-2.5 h after artificial pollination， used stigma dripping method to transfer into plasmids and agrobacteria which contained target genes； collect the mature seeds； selective culture and PCR certificated that the resistant materials of almost all treatments were integrated GFP and GUS genes. Moreover， compared with agrobacterium as target gene delivery， the plasmid gene delivery could harvest more fruits.

Key words： Dendrobium officinale， pollentube pathway， plasmid， agrobacterium， transgene

铁皮石斛（Dendrobium officinale）为兰科（Orchidaceae）石斛属（Dendrobium）多年生草本植物（张启香和方炎明，2005），是《中华人民共和国药典》中收载的5种石斛属植物之一，被称为石斛中的极品（邵华等，2004），有“中华九仙草”之首的美誉，是我国传统的名贵中药材，具有抗肿瘤、提高免疫力、降血糖、抗衰老等作用。由于铁皮石斛生长速度缓慢，对生长环境要求又十分苛刻，自然产量极为稀少，加上长期无节制的采集，致使天然的铁皮石斛濒临灭绝。利用生物技术进行人工繁殖和种质改良是解决这一问题的有效途径。目前，铁皮石斛组织培养技术已日趋成熟，但由于铁皮石斛野生资源繁多、品质良莠不齐，加之育种盲目、育种技术研究滞后，导致市场缺乏优良、富有特色的铁皮石斛新品种，铁皮石斛产业发展缓慢（郑希龙等，2011）。为了适应铁皮石斛规模化栽培的生产需要，保障鐵皮石斛产业的持续发展，开展加强铁皮石斛抗病抗逆能力及药用成分含量高的优良品种的育种研究工作，迫在眉睫。常用的铁皮石斛育种方法有杂交育种、诱变育种、倍性育种及基因工程育种。其中，基因工程育种以其目的明确而受到青睐。

目前，植物遗传转化方法常用的有农杆菌侵染法、基因枪法及花粉管通道法等（胡峰等，2015）。由于铁皮石斛属于单子叶植物，对农杆菌不敏感，近年来利用一些添加物如AS虽然获得不少成功例子（石彩娟，2013）。但是，转化率普遍不高，获得的转化植株少，且使用农杆菌侵染法对植株损害大；基因枪法受体虽来源广泛，但易形成嵌合体，多基因拷贝的整合易出现共抑制和基因沉默现象，加之所用的仪器设备昂贵，限制其广泛应用。花粉管通道法技术简单，不需要装备精良的实验室，常规育种易于掌握，在应用时较为麻烦的是授粉前需要去雄套袋，而铁皮石斛花结构特殊，自然传粉困难，在采用花粉管通道法时无需套袋去雄，且人工授粉操作方便，易于控制；铁皮石斛种子和球莖小，可充分接触筛选抗生素，利于转化植株的筛选。花粉管通道技术由我国生物化学家周光宇等（1979）首次创立，指利用植物授粉后所形成的天然花粉管通道（花粉引导组织）经珠心通道将外源DNA携带进入胚囊，转化受精卵或其前后的生殖细胞（精子、卵子），由于它们仍处于未形成细胞壁的类似“原生质体”状态，且正在进行活跃的DNA复制、分离和重组，所以很容易将外源DNA片段整合到受体基因组中，以达到遗传转化目的（崔红等，2003）。花粉管通道法是以植物自身生殖系统为载体，直接将外源基因导入植物，克服了远缘杂交的一些障碍，是一种简便有效快速的育种途径。自创立以来，花粉管通道法在水稻（张德建，2015）、玉米（孟宪玉等，2014）、西瓜（许珺然等，2014）等多种植物的转基因育种中获得成功，且被国内近百家实验室应用（刘芳等，2007）。本研究旨在运用花粉管通道法将含有GFP及GUS基因片段的质粒pSuper1300、pBI 121以及相应的根癌农杆菌导入铁皮石斛，获得转化植株。目前，国内外尚未见到相关报道。因此，可为铁皮石斛的基因工程育种提供参考。

1材料与方法

1.1 材料

以广西植物研究所生物技术与野生珍稀植物保育中心引种的铁皮石斛浙江种群为转基因受体材料。所用的根癌农杆菌及质粒表达载体均由中国农大提供，抗性是利福平+庆大+卡那霉素，根癌农杆菌菌型为GV3101，GFP表达载体为pSuper1300（图1），GUS表达载体为pBI121（图2）。

1.2 铁皮石斛对卡那霉素的敏感性

1.2.1 原球茎对卡那霉素的敏感性配制培养基1/2 MS+NAA 0.2 mg·L1+香蕉 6%+AC 0.1%（pH6.0），高压灭菌后冷却至60 ℃左右，加入不同浓度梯度的硫酸卡那霉素（表1）；每个处理3瓶，摇匀冷却后，接入浙江种群的铁皮石斛原球茎，每瓶接种原球茎20粒；暗培养3 d后，转到温度（28±3）℃、光照时间10～12 h·d1、光照强度30～40 μmol·m-2·s1的条件下培养，每隔一段时间观测成活率，以不含抗生素的处理为对照。

1.2.2 种子萌发对卡那霉素的敏感性将成熟的铁皮石斛种子，无菌播种于含0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 mg·L1卡那霉素的萌发培养基1/2 MS+NAA 0.2 mg·L1+香蕉 6%+AC 0.1%（pH6.0）上，每个浓度各3瓶，暗培养2～3 d后，转到温度（28 ± 3）℃、光照时间10～12 h·d1、光照强度30～40 μmol·m2·s1的条件下培养，定期观测种子的萌发情况，确定致死和半致死浓度。

1.3 转导目标物及制备方法

本研究使用的目标转导物：（1）携带GFP和GUS基因片段的质粒pSuper1300和PbI 121；（2）含有质粒pSuper1300或PbI121的根癌农杆菌。

1.3.1 根癌农杆菌活化及培养在加有kan 50 mg·L1，rif 25 mg·L1的LB（pH7.4）平板上划线，28 ℃恒温培养。48 h后，挑取农杆菌单菌落接种于LB（pH7.4）液体培养基中（含卡那霉素和利福平各50 mg·L1），于28 ℃、200 r·min1振荡培养。

1.3.2 大量质粒的制备将含目的基因片段GFP、GUS的质粒pSuper1300和PbI121转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞（购自天根生物公司）中，制备大肠杆菌转化细胞。具体操作方法按照产品说明书进行（操作均按无菌条件的标准进行）。挑取转化得到的大肠杆菌菌落接种于LB（pH7.4）液体培养基中（含100 mg·L1卡那霉素和25 mg·L1利福平），于28 ℃、200 r·min1振荡培养至OD600值为1.0时，离心收集菌体。质粒提取使用天根质粒小提中量试剂盒（TIANprep Midi Plasmid Kit离心柱型）进行，具体操作方法按照产品说明书进行。

1.4 转化方法

花粉管通道法导入外源基因的主要技术方法：（1）柱头滴加导入法；（2）子房注射法；（3）花粉粒携带法；（4）柱头涂抹法。由于铁皮石斛花较小，使用子房注射法操作比较困难，且易造成花朵的损伤，本研究主要使用的是柱头滴加导入法。授粉方式：本研究采取种群间杂交的方法进行授粉，母本为铁皮石斛浙江种群，父本为形态上与浙江种群差异较大的其它种群。人工授粉后0.5～2.5 h内导入目标物，定期观测结实情况，统计结实数。

1.5 转化植株的检测

1.5.1转化植株的筛选 将花粉管通道法导入外源基因后得到的种子，播种于含卡那霉素100 mg·L1（致死浓度）的萌发培养基中，暗培养2～3 d后，转到温度（28 ± 3）℃、光照时间10～12 h·d1、光照强度30～40 μmol·m2·s1的条件下培养，观察种子萌发情况。45 d后，将已经萌发的原球茎转接到含150 mg·L1（致死浓度）卡那霉素的分化培养基中，进一步筛选转化材料。

1.5.2 转化植株的PCR检测采用CTAB改良法（Doyle JJ & Doyle JL，1987）提取经过两次卡那霉素筛选存活的铁皮石斛DNA，进行PCR检测。

含GFP基因质粒或农杆菌转化植株的PCR检测引物序列为P2：ACAAGCTGGAGTACAACTACAA； P3：TACGAATTCCCGATCTAGTAAC。含GUS基因质粒或农杆菌转化植株PCR检测引物序列为P2：TCGTCGGTGAACAGGTATGGAA；P3：AGTGAATTCCCGATCTAGTAAC。

PCR反应总体系20 μL，使用GENEray即用型Taq酶PCR试剂盒。PCR扩增反应程序：95 ℃预变性1 min，94 ℃变性45 s，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环后，72 ℃延伸7 min，4 ℃保存，PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果。

2结果与分析

2.1 铁皮石斛对卡那霉素的敏感性

2.1.1 种子萌发对卡那霉素的敏感性培养基中添加卡那霉素，种子萌发明显受到抑制，而且随着浓度的增加，萌发所需要的时间越长。对照组（0 mg·L1）1周左右种子开始萌发；添加卡那霉素10～50 mg·L1的处理，30 d后才观测到浅黄色的胚状体长出；添加90 mg·L1以上的处理组，种子发白。60 d后观测，对照组均长出了嫩叶；添加60 mg·L1卡那霉素以下的处理组， 球茎膨大、 部分长出了小叶；添加70～80 mg·L1的处理组，极少数能发育为浅绿色球茎；添加90 mg·L1以上的处理组，种子基本全部死亡（图3）。根据这一结果，在筛选转化种子时，可添加100 mg·L1的卡那霉素到种子萌发培养基中进行选择培养。

2.1.2 原球茎对卡那霉素的敏感性低浓度（10～50 mg·L1）处理组中，原球茎生长受到抑制，但仍有生长现象，颜色浅绿色；中等浓度60～80 mg·L1处理组中，原球茎能存活，但几乎不生长，颜色浅黄绿色；高浓度的处理组（100 mg·L1以上）中，原球茎生长受到明显抑制，绝大部分发白死亡；当卡那霉素浓度达到150 mg·L1时，原球茎几乎全部变白死亡，如图4所示。根据这一结果，在第二次筛选转化球茎时，可添加浓度为150 mg·L1的卡那霉素到培养基中进行选择培养。

2.2 转化农杆菌和质粒的制备

2.2.1 携带目的基因农杆菌的制备通过活化及富集培养至菌液OD600值为0.4～0.6时，离心收集菌体，以2% 蔗糖+1/2 MS+0.1% silwet77+0.1% AS或5% 蔗糖+0.1% silwet77+0.1 mmol·L1 AS为悬浮液重悬至OD值0.5～1.0，直接滴加于柱头。

2.2.2 携带目的基因质粒的制备将质粒pSuper1300、质粒pBI121分别导入大肠杆菌感受态细胞，取100 μL菌液均匀涂布于含卡那霉素和利福平各50 mg·L1的LB培养基中，28 ℃恒温培养24 h，培养基中长出明显菌落，初步认定目标质粒成功导入大肠杆菌感受态细胞并且能够很好的表达。对转化的大肠杆菌进行富集培养，离心收集菌体，提取质粒DNA并PCR，1%琼脂糖凝胶电泳检测，证明质粒pSuper1300及质粒pBI121已整合到大肠杆菌感受态细胞中（图5，图6）。NanoDrop 2000/2000c微量紫外分光光度计测定质粒DNA浓度，用无菌去离子水调整至所需浓度，直接滴加于柱头。

2.3 花粉管通道介导转化法人工授粉

2.3.1 以农杆菌为转导物的人工授粉以含silwet77和AS、OD600为0.5～1.0农杆菌重悬液，在人工授粉后0.5～2.5 h内，使用柱头滴加法导入携带目的基因的根癌农杆菌，无需套袋，定时观察授粉结实情况，结果发现，在用农杆菌处理的360朵花中（花粉来源均为广西玉林种铁皮石斛），得到211颗果实，结实率为58.6%（表2）。

2.3.2 以质粒为转导物的人工授粉在导入质粒pBI121时发现，随着质粒浓度的增加，授粉后得到的果实数随之减少，说明高浓度的质粒可能影响授粉后的精卵结合。本实验所导入质粒的花朵数共480朵（花粉来源均为广西玉林种铁皮石斛），结实299颗，结实率为62.3%（表3）。

2.4 转化植株的筛选及检测

2.4.1 转化植株的筛选（1）种子萌发过程的筛选（第一次筛选）：将经转化处理的成熟铁皮石斛种子，无菌播种于含卡那霉素100 mg·L1的筛选培养基中培养，1周后发现几乎全部处理都有浅黄色的胚状体长出；4周后观测发现，低浓度pSuper1300（10～20 ng·μL1）和pBI121（10～20 ng·μL1）质粒转化处理的类原球茎大部分生长停滞，颜色变黄；另外，OD600值为1、含質粒pSuper1300农杆菌的转化处理的部分球茎颜色也出现类似情况。余下的其它处理类原球茎逐渐膨大成浅绿色的原球茎。可见，低浓度质粒和高浓度农杆菌的转化效果较差。根据上述结果初步判断，以质粒pSuper1300和pBI121为载体进行转化，其适合的转化浓度分别为40～600 ng·μL1和40～100 ng·μL1；以含pSuper1300和pBI121质粒的农杆菌为载体进行转化，其适合的转化浓度分别为OD600=0.5～0.9和OD600=0.5～1.0。

（2）原球茎培养过程的筛选（第二次筛选）：播种45 d后，将各处理萌发长出的原球茎转接到添加150 mg·L1卡那霉素的培养基中，进一步筛选转化植株。培养一段时间后发现，各处理组经第一次筛选出来的球茎均能继续存活，大部分能继续发育（图7）。假设每个处理存活的原球茎均为转化成功材料，每颗果实内含10 000粒种子（金银兵，2009）。各处理的转化率如表2、表3所示，结果显示，当菌液OD600=0.7～0.8、质粒浓度为100 ng·μL1时，转化率最高，其中含质粒pSuper1300（GFP基因）的农杆菌菌液OD600=0.7～0.8处理时转化率最高为5.0%，而含质粒pBI121（GUS基因）的农杆菌处理转化率最高为1.52%；导入质粒pSuper1300处理，转化率最高为7.84%，而导入质粒pBI121后，转化率最高为6.0%。

2.4.2 转化材料的PCR检测外源GFP和GUS基因的转化： 提取经两次卡那霉素选择培养仍存活的植物材料的总DNA，以未经转化处理植株DNA为对照，进行PCR扩增，结果如图8所示。从图8可以看出，在600 bp处，对照未能扩增出相应的条带；而转入GFP和GUS基因的各个处理均能扩增出明显清晰的条带，表明GFP和GUS基因片段已整合到铁皮石斛基因组中。

2.5 花粉管介导的铁皮石斛转基因技术小结

收集携带GFP和GUS基因的质粒（pSuper1300和pBI121）和农杆菌；用无菌去离子水重悬质粒pSuper1300和pBI121至浓度为100 ng·μL1，用2%蔗糖+1/2 MS+0.1% silwet77+0.1% AS或5% 蔗糖+0.1% silwet77+0.1 mmol·L1 AS重悬携带质粒pSuper1300和pBI121的农杆菌至菌液浓度为OD600=0.7～0.8；在授粉后0.5～2.5 h内使用柱头滴加法导入携带外源基因的质粒或农杆菌溶液，收集成熟的转化种子，经选择培养及PCR检测发现，几乎所有处理的转化材料均能检测出外源GFP和GUS基因片段。另外，与农杆菌相比，以质粒为载体进行转化，可获得更高结实率。

3讨论

花粉管通道技术可用于任何开花植物，不受受体物种、基因型和目的基因来源等因素的限制，无需组织培养、诱导再生等人工培养过程（侯丽霞等，2007），与目前使用较多的基因枪法和农杆菌介导法相比，其技术操作简单，普及和推广容易，契合现代农业日益追求的高效率要求，是一种行之有效的转基因育种方法。自创立以来，花粉管通道技术在多种植物尤其是农作物的转基因育种中获得了成功。本研究将花粉管通道技术运用于铁皮石斛遗传转化中，在国内外尚属首例。

花粉管通道法进行遗传转化时，多数以携带外源基因质粒为载体进行转化（刘芳等，2007），而本研究发现携带外源基因的质粒和农杆菌，均可作为载体通过花粉管介导法对铁皮石斛进行遗传转化。其中，与农杆菌相比，以质粒为载体获得了更高的结实率，这与李卉和武天龙（2007）的研究结论一致。不同的植物导入外源基因的时间不同，选择最佳的导入时间能有效地提高转化效率。孟宪玉等（2014）在研究玉米花粉管通道法转化外源基因时发现，在授粉18 h后进行转化操作，易于外源DNA的进入和整合，从而完成转化，而通过此方法对西瓜进行基因转化，最佳转化时间为授粉后24～27 h（许珺然等，2014）。本研究则发现运用花粉管通道介導法对铁皮石斛进行遗传转化时，导入外源基因的适合时间为授粉后0.5～2.5 h。

本研究使用花粉管通道技术达到的最高转化效率为7.84%，比武荣花等（2015）运用农杆菌介导法转化外源基因进入铁皮石斛的转化率低；但铁皮石斛果实内种子数以万计，成功转化植株的绝对数量并不低，因此，花粉管通道转化不失为铁皮石斛外源基因导入的一个有效方法，而且花粉管通道法克服了远缘杂交的一些障碍，打破了种、属间的限制，可以在不同科、属、种的植物中广泛筛选育种资源，进行更为远缘的杂交育种，培育新品种或创造新物种，这为铁皮石斛产业的发展提供了新的道路。因此，本研究仍具有重要的科学和应用价值，通过对本方法的进一步研究和优化，将为最终实现高效稳定的铁皮石斛外源基因导入方式提供科学依据。

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