余进德 熊宏 宋健 陈海涛 刘小烛 丁勇

摘要： 油质蛋白基因对种子中油体的形成至关重要，该研究通过实时荧光定量PCR，对麻疯树的两个油质蛋白基因JcOle14.3和JcOle16.6在种子不同发育时期的表达模式进行了分析。结果表明：两个基因在种子发育初期（10～30 d）表达量逐渐升高，但表达水平均较低；40 d时表达量急剧增加并达到最高，而种子发育后期（50～55 d）两个基因表达水平均逐渐降低。由此可初步推测，JcOle14.3和JcOle16.6基因的表达量可能与种子油脂积累量存在正相关。该研究结果为麻疯树油体形成机理和油质蛋白的深入研究提供了理论基础。

关键词： 麻疯树， 种子， 油质蛋白， 荧光定量， 表达分析

中图分类号： Q943.2文献标识码： A文章编号： 10003142（2017）09109605

Abstract： The oleosin gene is very important to the formation of oil body in seeds， present study analyzed the expression patterns of oleosin genes JcOle14.3 and JcOle16.6 in different development stages of Jatropha curcas seeds by quantity RTPCR， and the results showed that the expression levels of JcOle14.3 and JcOle16.6 were increased gradually at the early development stage （10-30 d） of seeds， but the levels were low. However， on the 40th day after pollinated， the expression levels of these two genes increased dramatically and arrived the highest， and the levels were reduced at the late development stage （50-55 d） of seeds. The results could be presumed that the expression 1evels of JcOle14.3 and JcOle16.6 may have the positively correlation with the lipid accumulation in the seeds.

Key words： Jatropha curcas， seeds， oleosin， quantity RTPCR， expression analysis

麻疯树 （Jatropha curcas） 为大戟科（Euphobiaceae）麻疯树属（Jatropha）多年生落叶灌木或小乔木（刘志军等，2005），主要分布于中美、南美、东南亚、印度和非洲（Choodhury，2001），在我国产于广东、广西、云南、四川、贵州、台湾、福建和海南等地（张明生等，2005）。麻疯树植物油脂含量很高，并主要以油体的形式储存于种子中，其含油率高达40%～60%（王岩等，2007），是目前最具潜力的生物柴油原料（王涛，2005；Wu et al，2009）。

植物油脂作为理想的生物柴油之一，广泛存在于植物的根、茎、叶、花和种子中，但主要以油体的形式存在于种子中（Huang，1992，1996），并可为种子的萌发和幼苗的生长提供能量储备（Wanner et al，1981）。油体由中性脂肪、磷脂质和蛋白质组成。从结构上看，油体内部主要为液态的三酰甘油酯中性脂肪，外层则被磷脂单分子层及附着于其上的油体结合蛋白所包被，而油体结合蛋白包括油质蛋白（oleosin）、油体钙蛋白（caleosin）、油体固醇蛋白A（steroleosinA）和油体固醇蛋白B（steroleosinB）（Tzen et al， 1990，1997；丁勇等，2012），其中oleosin最早被发现，且含量最丰富，占90%左右。研究表明，作为最主要的油体相关蛋白，oleosin可能对油体的形成、稳定及油脂代谢等过程均起着重要的生物学作用（Tzen & Huang，1992；Chen et al，1999；Millichip et al ，1996；Naested et al，2000）。截至目前，oleosin基因已从麻疯树、芝麻（Sesamum indicum）（Chen et al，1999；Lin et al，2002）、油菜（Brassica campestris）（Murphy et al，1989；Keddie et al，1992；丁勇等，2008，2010）、水稻（Oryza sativa）（Frandsen et al，1996）和拟南芥（Arabidopsis thaliana）（Naested et al，2000）等植物中分离克隆。Wu et al（1999）研究发现，oleosin基因以为数不多的基因家族形式存在，其中在裸子植物中仅发现一种oleosin基因，在被子植物中有两种不同的oleosin蛋白异构体，并且存在于同一油体上（Tzen et al，1998），而在麻疯树中，本课题组已克隆了两个oleosin基因：JcOle14.3（GenBank：JX073623）和JcOle16.6（GenBank：JX073622）（宋健等，2016；熊宏等，2016），表明麻疯树中oleosin基因亦以基因家族的形式存在，该文在此基础上对这两个基因进行了深入研究。

当油体在植物种子中开始形成时，oleosin基因随即转录并翻译成油质蛋白，这些油质蛋白镶嵌于油体表面，并且具有电荷斥力和空间位阻效应，从而维持了油体结构的稳定性（Tzen & Huang，1992）。Murphy et al（1989）研究表明，油菜種子在发育早期（花后前6周），oleosin 的mRNA表达量较低，而在花后6～12周，即油体的大量形成与稳定时期，mRNA表达量迅速增高并维持在较高水平。同样的结果显示，在芝麻种子的发育过程中，oleosin基因亦有相似的表达模式（Lin et al，2002）。然而，麻疯树种子作为最具潜力的生物柴油来源，其发育过程中oleosin基因JcOle14.3和JcOle16.6的表达特性尚未见报道。该文拟从麻疯树种子的不同发育时期研究JcOle14.3和JcOle16.6基因的表达模式，进而阐明oleosin基因在麻疯树种子中的表达特性，为麻疯树油体形成机理以及oleosin蛋白的深入研究提供理论基础，同时为利用麻疯树进行生物柴油的生产提供重要的实践指导意义。

1材料与方法

1.1 材料

麻疯树种子采自于云南省西双版纳热带植物研究所。在麻疯树花序未开放时去除雄花并进行套袋，当雌花开放时进行人工授粉，授粉当天记为种子发育0 d，授粉后对不同发育阶段（10、20、30、40、50和55 d）的种子进行取样：选取9株植株，并以每3株植株上的种子混合为1个样品， 3次重复，每个发育阶段的取样方法与上相同。样品用液氮速冻后保存于-80 ℃低温冰箱备用。

1.2 方法

1.2.1 样品RNA的提取及反转录种子样品总RNA提取参照丁勇等（2012）的方法进行，cDNA的合成按照RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒说明合成。

1.2.2 基因表达分析利用荧光定量PCR对麻疯树种子不同发育阶段的JcOle14.3和JcOle16.6基因进行表达模式分析，每个样品3次重复。荧光定量PCR 采用SYBR Green master mix （Fermentas）法进行。JcOle14.3引物为JcOle14.3qF（5′GGATCTCTTCTAGTTCTCT3′），JcOle14.3qR（5′TGAATATGACCAGCAATG3′）；JcOle16.6引物为JcOle16.6qF（5′AGCCACACGTTCAAG3′），JcOle16.6qR（5′TCTGAGCTGATGGACCTT3′）；内参基因18S（GenBank： AY823528.1）引物为18SqF（5′ACATAGTAAGGATTGACAGA3′），18SqR（5′TAACGGAATTAACCAGACA 3′）。PCR反应程序为95 ℃解链15 s，60 ℃同时复性延伸 30 s，40 个循环。基因相对表达量的计算方法采用 2-△△ Ct 法。

2结果与分析

2.1 JcOle14.3基因表达模式分析

以麻疯树种子发育第10天作为对照，对麻疯树JcOle14.3基因在种子不同发育阶段的相对表达量进行了荧光定量PCR分析，结果显示（图 1），JcOle14.3基因在整个种子发育过程中均有表达，在种子发育初期（10～30 d），表达量有逐渐升高的趋势，但表达较低，而在发育40 d时，JcOle14.3表达量急剧增加并达到最高，是种子发育10 d的90多倍，而在发育后期（50～55 d）表达量开始下降。

2.2 JcOle16.6基因表达模式分析

以同样的方法对麻疯树JcOle16.6基因在种子不同发育阶段的表达模式进行了分析。图2结果显示，JcOle16.6表达情况与JcOle14.3相似，在种子发育40 d前，JcOle16.6表达量逐渐升高，在授粉后40 d表达量急剧增加并达到最高，为种子发育10 d的110多倍，而发育40 d后表达量亦开始下降。

3讨论

麻疯树种子是最具潜力的生物柴油（王涛，2005；Wu et al，2009），而种子中的油体是開发生物柴油的前提，故油体的形成至关重要。本研究在种子发育过程中，oleosin基因JcOle14.3和JcOle16.6的表达情况对油体的形成、稳定和大小均起到重要作用。本研究表明，JcOle14.3和JcOle16.6在种子发育阶段的表达呈先升高后降低的趋势，在发育初期（10～30 d），两个基因的表达量均较低，而第40天表达量迅速增加并达到最高，40 d后两个基因的表达量又逐渐降低。本研究推测麻疯树种子发育初期因油体形成量较少，故JcOle14.3和JcOle16.6表达量虽然逐渐增加，但表达量较低。发育至40 d时，种子中的油体大量形成并得以逐渐稳定，两个基因的表达量也急剧增加并达到最大值。40 d后，即种子成熟后期，油体形成量逐渐减低，表达量亦随之降低。文锦芬等（2014）的研究表明，在麻疯树果实发育过程中，与油脂合成相关的酰基辅酶A结合蛋白基因（JcACBP）的表达也表现先升高后降低的趋势，但该基因的表达在发育后期才略有下降，而本研究JcOle14.3和JcOle16.6基因的表达在种子发育后期具有明显的下降趋势。造成以上结果不同的原因可能是由于麻疯树的生境及其种子成熟期存在差异所致。如文锦芬等（2014）实验材料采自云南昆明，JcACBP的表达在种子发育50 d时达到最高，而本研究的实验材料采自云南西双版纳热带植物研究所，种子发育40 d时 JcOle14.3和JcOle16.6就达到最大值。此外，油菜和芝麻中的oleosin基因在种子成熟后期也保持较高的表达水平（Murphy et al，1989； Lin et al，2002），这可能是由于不同物种的油脂积累模式不同，从而oleosin基因的表达模式不同所导致。

以往研究表明，麻疯树JcACBP基因的表达量与油脂含量变化趋势基本一致（文锦芬等，2014），而本研究结果显示JcOle14.3和JcOle16.6的表达模式与JcACBP相似，暗示JcOle14.3和JcOle16.6的表达量与麻疯树油脂合成亦存在正相关性。

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