柴雅红 章英才

摘要： 以宁夏4个不同地区（灵武、中宁、青铜峡、银川）成熟期的灵武长枣果实为研究对象，经水提醇沉法提取，采用DEAEcellulose52和HW55S分离纯化，并利用GCMS法进行多糖的单糖组成分析。结果表明：多糖提取率最高的是灵武地区，达到1.795%；分离纯化后，4个地区的长枣多糖各得到1个中性（Ju0）和3个酸性组分（Ju1、Ju2、Ju3），其中Ju2含量最高；GCMS分析可知灵武长枣多糖含有阿拉伯糖、鼠李糖、核糖、岩藻糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸10种单糖，不含果糖，以阿拉伯糖、核糖、半乳糖和2种糖醛酸为主，木糖含量最低。各地区多糖的单糖组成、含量各不相同，从各组分来看，四个地区多糖的Ju0和Ju1组分组成均以阿拉伯糖、核糖、半乳糖为主，四个地区多糖的组成差异主要在于Ju2和Ju3组分。从各地区单糖总量来看，灵武地区是阿拉伯糖含量最高，中寧、青铜峡、银川地区以葡萄糖醛酸含量为最高。

关键词： 灵武长枣， 多糖， 提取， 分离纯化， 单糖组成

中图分类号： Q946.3文献标识码： A文章编号： 10003142（2017）09118708

Abstract： Fruits of Ziziphus jujube cv. Lingwuchangzao at mature stage from different areas in Ningxia（Lingwu， Yinchuan， Zhongning， Qingtongxia） were used as the experimental materials. The water extraction and alcohol precipitation method were adopted to obtain polysaccharide， which was subsequently purified by DEAE52 cellulose column and HW55S gel column. Finally gas chromatographymass spectrography（GCMS） was used to analyze the monosaccharide composition from purifed polysaccharides. The results showed that the crude polysaccharides from Lingwu had the highest yield， 1.795%. After purifed， all polysaccharides were fractioned respectively to one neutral fraction，Ju0， and three acid fractions，Ju1， Ju2， Ju3，and Ju2 had the highest contents. This indicated that the main components of polysaccharides in Z. jujube cv. Lingwuchangzao were acid fractions. The results from GCMS showed that Z. jujube cv. Lingwuchangzao were composed of arabinose， rhamnose， ribose， fucose， xylose， mannose， galactose， glucose， glucuronic acid and galacturonic acid， but monosaccharide contents were different among different fractions. Arabinose， ribose， galactose， glucuronic acid and galacturonic acid were the main components， and the content of xylose was the lowest. Both Ju0 and Ju1 were mainly composed by arabinose， ribose， galactose， while Ju2 and Ju3 exist obvious differences between four areas. According to the comparision of the total contents of monosaccharides， the content of arabinose in polysaccharides from Lingwu reached the highest， accounting for 28.6% of the total contents of monosaccharides， but other areas only accounted for 13%-18.9%. Meanwhile， glucuronic acid reached 21%-26.5% in polysaccharides from other three areas， but it was only 2.6% in polysaccharides from Lingwu. This indicates that the key difference in monosaccharide composition of polysaccharides from different areas lies in the content of arabinose and glucuronic acid. The advantages of polysaccharides in Z. jujube cv. Lingwuchangzao from Lingwu mainly are high content of arabinose and low content of glucuronic acid， which is likely to be one of key factors of the difference in fruit quality. This study will provide basis and scientific support for further of development and utlization of the fruits of Z. jujube cv. Lingwuchangzao.

Key words： Ziziphus jujube cv. Lingwuchangzao， polysaccharides， extraction， purification， monosaccharide compositions

灵武长枣（Ziziphus jujube cv. Lingwuchangzao），属鼠李科枣属植物，为宁夏回族自治区特有的优质鲜食枣品种，已有800多年的栽种历史，其果实以个大、色红、风味酸甜适中、营养丰富而驰名（喻菊芳等，2004）。灵武长枣不仅是滋补佳品，也是传统中药，具有补中益气，养血安神的功效（苟茜等，2014）。枣多糖是灵武长枣中具有重要生物功能的有效成分，具有抗氧化、抗肿瘤、抗疲劳、提高机体免疫力等功能（姜晓燕等，2009； 颜小捷等，2012； Wang et al， 2010； 丁玉松等，2010），而多糖糖链的一级结构与其活性密切相关，一级结构的研究主要体现在组成多糖的单糖种类及各单糖的组成比例。灵武长枣果实所积累糖的含量、种类及比率的不同是果实品质差异的重要因素，果实多糖的单糖成分不仅决定着果实甜度和风味，而且是其他品质成分和风味物质合成的基础原料，对果实品质起关键性作用（Teixeira et al ，2005；章英才等，2014）。因此，弄清多糖的单糖组成对控制多糖质量标准及研究枣多糖活性也具有重要意义。

目前，灵武长枣以灵武市为主栽区，种植面积达0.9万hm2，中宁、青铜峡、银川等周边地区也有栽种，但其外观、品质因产地、环境条件不同而呈现一定差异。随着营养价值、药用价值逐渐被人们认识，市场需求逐年加大，出现了长枣果实品质参差不齐，灵武长枣果实风味变淡，口感变差，已严重危及到灵武长枣的产业发展（张晓波，2014）。这很可能与各个产地具有品质差异的果实相继涌入市场有关。因此，明确灵武地区长棗品质的产地优势，以及不同产地间品质差异的关键显得尤为重要，从而为控制提高其多糖质量标准，调整优化种植结构提供技术支撑。近年来，灵武长枣在栽培管理（万仲武等，2013）、品种选育（喻菊芳等，2008）、生理生化（魏天军等，2008）等方面已有研究，但其多糖的研究目前仅限于多糖的提取、含量测定及变化规律（杨军等，2011）等方面，而有关灵武长枣多糖的组成、不同产地长枣主要有效成分比较方面尚缺乏系统研究。

本研究选择宁夏灵武及其周边3个主要枣产区（中宁、青铜峡、银川）的灵武长枣果实作为材料，采用水提醇沉法提取粗多糖，经DEAE52纤维素柱、HW55S凝胶柱分离与纯化，用GCMS法对于纯化后的精多糖进行单糖组成和含量方面的分析比较，旨在为宁夏不同地区灵武长枣多糖的开发利用及产业发展提供科学依据。

1材料与方法

1.1 材料

以宁夏灵武、中宁、青铜峡、银川的成熟期的“普通型”灵武长枣果实为供试材料，经45 ℃烘干至恒重，用粉碎机完全粉碎后过筛备用。

1.2 仪器与试剂

DEAE52纤维素柱（Φ 2.6 cm × 40 cm）（上海琪特仪器有限公司）、HW 55S凝胶柱（Φ 1.6 cm × 50 cm）（上海琪特仪器有限公司）、SBSZ100数控计滴自动部份收集器（上海沪西分析仪器厂有限公司）、YZ1515X恒流泵（保定兰格恒流泵有限公司）、722N可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）、QP2010气相色谱-质谱联用仪（日本岛津）。

DEAE52纤维素填料（Whatman）、TOYOPEARL HW55S凝胶树脂填料（日本TOSOH）。标准单糖：葡萄糖（99.5%）、阿拉伯糖、果糖、半乳糖、甘露糖（均>99%）购自北京拜尔迪公司；核糖（99.6%），岩藻糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸（>99%）购自国家标准物质网；鼠李糖、木糖（均>98%）购自北京化学试剂公司。六甲基二硅胺烷、三甲基氯硅烷为色谱纯，其余试剂均为分析纯。本研究所用水均为超纯水。

1.3 方法

1.3.1 灵武长枣粗多糖的提取 参照何进等（1995）的方法，略有改动。具体步骤：精确称取15 g枣粉置于滤纸筒，放于加入100 mL石油醚的索氏提取器中，80 ℃回流脱脂8 h；过滤后的残渣置于80%乙醇的普通回流装置中85 ℃回流2次，每次75 mL，每次2 h，脱去小分子糖；过滤后的残渣再用沸水提取3次，50 mL每次，t1=1.5 h，t2=1 h，t3=1 h，离心后合并上清液经40 ℃真空浓缩约为40 mL；浓缩液与1/4体积的Sevag 试剂混合，震荡混合，静置，分出氯仿层，除去蛋白质，此步骤重复多次；除蛋白后的浓缩液加入4倍体积无水乙醇进行醇沉，使多糖浓度达到80%，置于4 ℃冰箱静置过夜，滤纸过滤沉淀后的滤渣依次用50 mL 95%的乙醇、无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，最后在50 ℃鼓风恒温箱里干燥得到粗多糖。

1.3.2 灵武长枣多糖的分级纯化DEAECellulose（OH-）色谱柱分级：取粗多糖60 mg溶于超纯水，配成浓度为6 mg·mL1的多糖溶液，过滤后，加样至已装好的DEAE52纤维素柱（有效柱长35 cm），梯度洗脱法洗脱各级分，洗脱液分别为超纯水、0.1 mol·L1 、0.2 mol·L1 、0.3 mol·L1 NaCl，流速1 mL·L1，自动部分收集器自动收集洗脱液，5 mL每管，每管5 min，硫酸-苯酚法跟踪检测，490 nm下检测吸光度，以洗脱管数为横坐标，吸光值为纵坐标，作DEAECellulose（OH-）色谱柱洗脱曲线。分别合并各主峰收集管液，采用旋转蒸发仪45 ℃真空浓缩，超纯水下流水透析48 h，静置透析24 h（选择截留相对分子质量为3 500透析袋），每4 h更换一次超纯水，收集透析袋内的多糖溶液，真空浓缩，冷冻干燥，得到各多糖级分。

TOYOPEARL HW55S色谱柱纯化：将上述冷冻干燥的各多糖级分分别溶于2 mL超纯水中。加样至HW55S色谱柱（有效柱长42 cm），0.2 mol·L1Nacl洗脱，流速为0.5 mol·min1，4 mL每管，硫酸-苯酚法检测，以洗脱管数为横坐标，吸光值为纵坐标，作洗脱曲线。收集、透析、浓缩，冷冻干燥，得各精制多糖。

1.3.3 灵武长枣果实精制多糖的组成分析在参照林勤保等（2009）的方法基础上，进行了实验条件摸索和改进。

1.3.3.1 果实精制多糖的水解精确称取果实精制多糖4 mg于反应釜中，加入0.4 mL 2 mol·L1的三氟乙酸（TFA），置于烘箱内110 ℃水解3 h，冷却至室温，放入真空干燥箱中70 ℃减压干燥。

1.3.3.2 果实精制多糖的衍生将水解干燥后的灵武长枣果实精制多糖加入0.4 mL吡啶，迅速加入0.08 mL三甲基氯硅烷和0.16 mL六甲基二硅胺烷，注意操作要迅速，防止空气中水分的进入。振荡待其充分溶解后，于50 ℃恒温干燥箱中反应40 min，冷却至室温，用0.45 μm微孔滤膜过滤后，滤液3 000 r·min1离心10 min，取上清液稀释1.5倍后进行气相色谱-质谱联用测定。

1.3.3.3 GCMS检测条件气相色谱条件：色谱柱为DB5MS（3 m × 0.25 mm × 0.25 μm），进样口温度250 ℃，接口温度250 ℃，载气为氦气，柱压73.0 kPa，柱流量1.00 mL·min1，分流比50∶1，程序升温从100 ℃保持2 min，以10 ℃·min1升至260 ℃，保留10 min；进样量为0.1 μL。质谱条件：离子源温度200 ℃，M/Z范围为35～800。

1.3.3.4 标准曲线的制作取各标准单糖，衍生后进行GCMS测定，方法同1.3.3.2，1.3.3.3。

1.3.3.5 果实精制多糖中单糖组成的定性与定量通过NIST谱库及各标准单糖标品的比对，根据峰面积采用外标法进行定量分析， 根据各单糖的回归方程计算出多糖中单糖的含量，保证定性、定量分析的准确性。

外标法定量计算公式： W=C × V

式中，W为单糖质量，C为带入标准曲线求得的单糖浓度，V为稀释后体积

2结果与分析

2.1 多糖的提取结果

经过上述方法提取的干燥粗多糖，灵武、银川、中宁、青铜峡地区的粗多糖得率分别为1.795%，0.635%，0.618%，0.596%；多糖含量分别为63%，49.14%，47.15%，40.46%。

2.2 分级纯化结果

灵武长枣果实粗多糖分别经DEAE纤维素柱层析后，分离得1个中性组分级分Ju0和3个酸性组分Ju1、Ju2、Ju3。经多糖含量计算发现，多糖含量均因组分不同而差异较大，在不同地区果实精制多糖中酸性多糖含量均高于中性多糖含量，尤其是Ju2含量丰富。将各组分分别经HW55凝胶柱纯化后，得到单一对称的洗脱峰，说明HW柱对多糖纯化效果理想。经分离纯化后得灵武、银川、中宁、青铜峡精制多糖得率分别为0.193%，0.131%，0.136%，0.129%，灵武地区精制多糖得率最高。

2.3 GCMS分析结果

各单糖标准品经衍生后，在检测条件下测得各标品衍生物的总离子流图，如图1所示。

根据GCMS得出的总离子流图，经分析计算得出，不同地区各组分单糖组成及其含量如表2所示。

由表2可知，总体上，各地区灵武长枣多糖均含有阿拉伯糖、鼠李糖、核糖、岩藻糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸这10种单糖，不含果糖，主要以阿拉伯糖、鼠李糖、核糖、半乳糖、糖醛酸为主，木糖含量最低。针对不同组分：Ju0中，均不含木糖，均以阿拉伯糖>核糖>半乳糖为主。Ju1中，也以阿拉伯糖、核糖、半乳糖为主。Ju2中，差别较大，灵武地区以阿拉伯糖>半乳糖为主；银川以葡萄糖醛酸>半乳糖醛酸>核糖>阿拉伯糖为主；中宁以半乳糖醛酸>鼠李糖>阿拉伯糖为主；青铜峡以葡萄糖醛酸>半乳糖醛酸>半乳糖>鼠李糖>阿拉伯糖为主。Ju3中，灵武以阿拉伯糖>鼠李糖为主，银川以葡萄糖醛酸>阿拉伯糖>鼠李糖为主；中宁以葡萄糖醛酸>半乳糖醛酸>阿拉伯糖>鼠李糖；青铜峡以葡萄糖醛酸>鼠李糖为主。

从各组分单糖总量来看，所有中性组分Ju0均是阿拉伯糖含量最高。灵武地区酸性组分均阿拉伯糖含量最高，其含有的葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸的含量明显小于其他三个地区，且仅在Ju1组分出现；银川、中宁、青铜峡地区：在含有葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸的酸性组分中，均是葡萄糖醛酸含量最高；在不含有葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸的酸性组分中，仍是阿拉伯糖含量最高。从各地区单糖总量来看，灵武以阿拉伯糖含量最高，达到总单糖含量的28.6%，其余地区为13%～18.9%；中宁、青铜峡、银川地区为葡萄糖醛酸含量最高，达到21%～26.5%，而灵武仅占2.6%；其余多糖在不同地区间含量基本接近，木糖含量最低，仅占0.26%～0.47%。

灵武：单糖组成以阿拉伯糖>鼠李糖>半乳糖>核糖。银川：以葡萄糖醛酸>半乳糖醛酸>阿拉伯糖>鼠李糖>半乳糖。中宁：以葡萄糖醛酸>阿拉伯糖>半乳糖>核糖>鼠李糖>半乳糖醛酸。青铜峡：以葡萄糖醛酸>半乳糖醛酸>半乳糖>阿拉伯糖>核糖>鼠李糖。

3讨论与结论

本研究用热水浸提法提取不同地区多糖，发现灵武地区粗多糖得率和含量为最高，分别为1.795%、63%，看来灵武长枣多糖的得率与含量关系密切；采用DEAE52纤维素层析柱对不同地区粗多糖进行分离纯化，均得到1种中性多糖和3种酸性多糖，表明灵武长枣多糖的主要形式为酸性多糖，各地区均以酸性组分2得率最高；柳杨（2011）的研究结果表明灵武长枣各多糖组分分子量最大为1.60×105，最小为7.61×104，采用适用分离多糖分子量范围为1 000～2×105的HW55S填料，得到的洗脱峰为对称的单一峰，效果较好。本研究用GCMS分析单糖组成发现，总体上，各地区灵武长枣多糖均含有10种单糖，包括5种六碳糖（鼠李糖、岩藻糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖），3种五碳糖（阿拉伯糖、木糖、核糖），2种糖醛酸（葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸），主要组成为阿拉伯糖、鼠李糖、核糖、半乳糖、糖醛酸。四个地区的多糖组分差异主要在于Ju2和Ju3。从各地区单糖总量来看，灵武以阿拉伯糖含量最高，达到总单糖含量的28.6%，其余地区为13%～18.9%，而阿拉伯糖是纤维、半纤维的合成单位，这可能与灵武地区长枣中较高的粗纤维含量有关（苟茜等，2014）说明灵武地区生长的灵武长枣比其他地区枣果实更适合作为膳食纤维的来源。中宁、青铜峡、银川地区为葡萄糖醛酸含量最高，达到21%～26.5%，而灵武仅占2.6%，说明不同产地长枣多糖的组成单糖的差异主要在于阿拉伯糖和葡萄糖醛酸含量的高低，灵武地区灵武长枣多糖的优势主要在于含量较高的阿拉伯糖和较低的葡萄糖醛酸，这可能是影响品质差异与活性的关键因素之一，希望在以后的研究中能明确影响阿拉伯糖、葡萄糖醛酸积累的关键因素，进而调控品质差异。王东营（2013）研究了滩枣多糖，发现滩枣多糖由阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖、葡萄糖、甘露糖、木糖、核糖、岩藻糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸10单糖组成，且阿拉伯糖含量最高，与本实验研究结果基本接近，但林勤保等（1998）用HPLC測得大枣中性多糖由L阿拉伯糖、D葡萄糖和D半乳糖组成，酸性多糖由L阿拉伯糖、L鼠李糖、D甘露糖、D半乳糖和D半乳糖醛酸组成，石浩等（2015）发现糖枣中木糖醇、葡萄糖、半乳糖所含比例较高，赵智慧等（2010）发现金丝小枣主要组成分为半乳糖醛酸，这与本研究结果有差异，这可能与枣种类不同、产地不同、多糖提取方法不同，成分分析手段不同等有关。

一般多糖组成分析的方法主要有高效液相色谱（HPLC）和气相色谱（GC）及气相色谱—质谱联用（GCMS）、液相色谱—质谱联用（HPLCMS）法。HPLC、GC是较常用的分析方法，但无法完成未知组分的定性，只能根据标准品一一对照，GCMS综合了气相色谱灵敏度高、分析速度快和质谱鉴别能力强的优点，可同时完成待测组分的分离和鉴定，特别适用于多组分混合物未知组分的定性和定量分析，且灵敏度很高（张艳华，2013），HPLCMS目前在植物多糖分析上应用较少，实验条件及设备尚不成熟。而本研究中灵武长枣多糖的单糖组分未知，因此选用GCMS法定性及定量，但多糖为大分子物质，不能直接挥发，因而须将多糖降解为结构单糖，并且将其衍生成易挥发，对热稳定的衍生物（叶林等，2010）。因此，本研究应用三氟乙酸水解多糖，甲基硅烷化衍生后进行GCMS分析多糖中单糖组成。该衍生化法操作简单、反应迅速，所得衍生物挥发性好，但是较易产生异构峰，给定性定量带来困难。本研究中以标准单糖衍生物的出峰时间和样品单糖衍生物的出峰时间相对照，并结合NIST谱库对照进行定性定量分析，使结果更加准确。本研究为枣多糖组成GCMS分析提供了快速、有效的检测条件与手段。

本研究首次阐明该种植物单糖组成情况，灵武长枣以阿拉伯糖和葡萄糖醛酸含量最为丰富，而阿拉伯糖，作为低热量糖，具有抑制蔗糖吸收作用，能抑制因蔗糖摄入而导致的血糖升高、抑制肥胖，预防治疗与血糖升高有关的疾病（秦海敏等，2006）；葡萄糖醛酸能与肝脏中有毒物质结合，起解毒作用（Sherlock，1962），说明灵武长枣具有作为功能产品开发与加工的潜力。本研究比较了在宁夏不同地区间果实多糖差异，造成多糖组成与品质差异的原因，可能与土壤、水分等生长环境因素有关，因宁夏地区间土壤差异较大，呈现较大的不均衡性（王吉智，1990）。这将在以后的研究中继续探讨，不同地区灵武长枣多糖的比较，可为灵武长枣的品质评价、开发利用及产业发展提供一定参考。

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