李冬

(盘锦职业技术学院医学分院，辽宁盘锦124000)

EV71感染对手足口病患儿DCs成熟、凋亡及MAPK信号通路和炎性细胞因子表达的影响

李冬

(盘锦职业技术学院医学分院，辽宁盘锦124000)

目的 探究肠道病毒71型(EV71)感染对手足口病患儿树突状细胞(DCs)成熟、凋亡及MAPK信号通路和炎性细胞因子表达的影响。方法 选择手足口病患儿40例，根据感染程度将患儿分为轻症感染组(20例)、重症感染组(20例)，另选取同期同年龄段健康儿童20例作为对照组。抽取各组DCs体外培养、诱导后检测表面标志的变化、细胞凋亡情况及MAPK信号通路活化情况，并对细胞培养上清中炎性细胞因子表达水平进行检测。结果 轻度感染组、重度感染组CD80、CD83及CD86阳性率随感染程度的加重而上升，其中CD80、CD83与对照组比较差异有统计学意义(P均<0.05)。对照组凋亡细胞检出率及死亡细胞检出率在三组中最高；轻度感染组凋亡细胞及死亡细胞检出率与对照组相比降低；重度感染组凋亡细胞及死亡细胞检出率最低；三组细胞凋亡率及死亡率比较差异有统计学意义(P均<0.05)。轻度感染组、重度感染组p-p38 MAPK、p-JNK、p-ERK1/2蛋白表达量均随感染程度加深而增加(P均<0.05)。IL-6及IL-12表达随感染程度的加重而呈上升趋势，其中IL-6变化明显，三组间比较差异有统计学意义(P均<0.05)，IL-12略有升高，三组间比较差异无统计学意义(P均>0.05)；TNF-α表达随感染程度的加重呈先升高后降低的趋势，三组间比较差异有统计学意义(P均<0.05)。结论 EV71感染可促进DCs成熟并分泌细胞因子，同时抑制其凋亡，活化MAPK信号通路，上调炎性细胞因子表达。

肠道病毒71型；树突状细胞；MAPK信号通路;炎性细胞因子

肠道病毒71型(EV71)是儿童手足口病的主要致病源[1]，其感染人数逐年上升。EV71感染所致手足口病起病急、发展快[2]，轻度感染患儿预后良好，重度感染患儿多伴随脑膜炎等并发症[3]，且致残致死率高。目前针对该类手足口病尚无有效的疫苗及药物。研究显示EV71可使感染患儿体液免疫系统紊乱[4]，并通过感染树突状细胞导致炎性细胞因子表达改变。2014年12月，我们通过比较手足口病不同感染阶段儿童树突状细胞(DCs)体外培养、诱导后成熟及凋亡情况、MAPK信号通路活化情况及炎性细胞因子表达变化情况，以期为EV71型手足口病疫苗的研究及开发提供更多参考。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2014年6～12月我院收治并确诊的手足口病患儿40例作为感染组,男22例、女18例,年龄10个月～9岁。根据《手足口病诊疗指南(2010年版)》对患儿进行诊断并评估病情，其中20例为轻度感染患儿(轻度感染组)，20例为重度感染患儿(重度感染组)。另选取同期同年龄段健康儿童20例作为对照组。感染组及对照组儿童年龄、性别具有可比性。均于入院24 h内采集外周血2 mL，置于EDTA-K2抗凝管中。

1.2 DCs分离培养 裂解外周血血浆中红细胞，离心获得单个核细胞(PMBC)。吸出的PMBC经无血清RPMI1640洗涤并以2×106/mL接种于T25细胞培养瓶中，37 ℃、5%CO2条件下静置培养2 h。轻柔洗去未贴壁细胞，余下即为单核细胞。单核细胞采用完全培养基(RPMI1640+10%FBS)、100 U青链霉素抗生素，37 ℃、5%CO2条件下培养，并加入100 ng/mL 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、50 ng/mL IL-4以诱导DCs分化。2～3 d换液1次，连续培养7 d后收获。

1.3 DCs表面标志物细胞数检测 取感染组及对照组诱导培养后DCs直接用荧光抗体染色标记，抗体为PE标记的鼠抗人CD11c、CD80、CD83、CD86，阴性对照采用PE标记的鼠抗人Ig。用流式细胞仪检测细胞阳性比例，对单核细胞进行免疫表型分析，根据免疫表型分析结果比较两组DCs成熟度。

1.4 细胞凋亡检测 采用Annexin V/PI双染色法对诱导培养后的DCs凋亡情况进行检测。取感染组及对照组诱导培养后细胞各490 μL，每组加入FITC-Annexin V 5 μL和PI 5 μL,避光温浴10 min，PBS洗涤。每组取1×105个细胞经流式细胞仪分析。在488 nm氩离子激光器下，FITC呈绿色荧光，PI呈红色荧光。保存流式细胞仪检测结果，并用相关分析软件进行结果处理。

1.5 信号通路蛋白检测 各取感染组和对照组诱导培养后的细胞5×106个，裂解细胞并提取总蛋白，用Western blotting法检测两组细胞p-p38 MAPK、p-JNK、p-ERK1/2蛋白表达情况，将胶片进行扫描，用凝胶成像分析系统分析蛋白磷酸化水平，将各样品p-p38 MAPK、p-JNK、p-ERK1/2蛋白表达量与对应GAPDH相除，得到相对表达量。

1.6 外周血炎性细胞因子检测 收集感染组及对照组的细胞上清液，采用双抗夹心ELISA法对外周血中细胞因子进行定量检测。检测的细胞因子包括IL-6、IL-12及TNF-α。

2 结果

2.1 EV71感染对DCs成熟的影响 诱导培养后的对照组细胞多为贴壁细胞，细胞无毛刺样凸起；感染组细胞多为悬浮细胞，细胞周围有毛刺样凸起产生，且毛刺较长。三组DCs表面标志物检测结果比较见表1。

表1 三组DCs表面标志物检测结果比较(%，±s)

2.2 EV71感染对DCs凋亡的影响 Annexin V/PI双染色法中早期凋亡细胞可被FITC染色，晚期凋亡细胞及坏死细胞可被PI染色。对照组、轻度感染组、重度感染组细胞凋亡率分别为(54.89±7.10)%、(30.18±5.33)%、(16.41±1.39)%，死亡率分别为(21.77±6.13)%、(14.25±5.37)%、(1.56±0.73)%，三组细胞凋亡率及死亡率比较差异有统计学意义(P均<0.05)。

2.3 三组EV71感染后信号通路活化情况比较 见表2。

2.4 三组细胞因子定量检测结果比较 见表3。

3 讨论

EV71导致的儿童手足口病症状较其他病毒引发的疾病更严重，部分患儿会产生严重后遗症。目前临床主要为抗病毒化学药物及细胞因子等治疗，效果不佳。因此，制备有效的抗病毒疫苗成为EV71防治的重心。DCs是体内最重要的抗原递呈细胞，未成熟DCs的主要功能为摄取加工抗原及随体内循环系统迁移，成熟DCs负责递呈抗原以刺激T细胞增殖并激活免疫系统[5]。病毒感染机体后首先遇到的就是DCs[6]，DCs可被病毒感染，亦能摄取病毒感染的细胞，同时又是机体适应性T细胞免疫应答的激活者[7]。CD83作为成熟DC特有的表面标志，通常被用来识别和分离成熟DCs；CD86、CD80、CD11c亦是成熟DCs表达的重要共刺激因子，其表达量上调代表DCs成熟[8]程度的加深。本研究中，轻度感染组、重度感染组各标志物的表达均高于对照组，其中CD83、CD80的上调与对照组相比差异有统计学意义，表明EV71感染对DCs成熟起到明显促进作用。成熟DCs在激活机体免疫系统的同时分泌各种炎性细胞因子，参与免疫应答并发挥免疫调节作用[9]。本实验结果表明，随感染程度的加深，IL-6、IL-12均显著增加，而TNF-α在感染初期表达水平较高，而在重度感染时反而出现降低现象。炎性因子的增加又可继续刺激DC细胞成熟，成熟DCs可能对EV71繁殖有抑制作用[10]。而重度感染时TNF-α表达下降，推测是由于DCs成熟程度较高，对TNF-α产生了负反馈而导致。彭宏君等[11]发现，感染可促进DCs成熟、提高体外培养DCs活性并增强炎性细胞因子表达，与本实验结果一致。

表2 三组p-p38 MAPK、p-JNK、p-ERK1/2蛋白表达量比较(±s)

表3 三组细胞因子定量检测结果比较(pg/mL，±s)

研究[12]表明，p38MAPK信号转导通路参与介导DCs的凋亡。p-p38 MAPK、p-JNK、p-ERK1/2蛋白均为此信号通路的重要节点，其含量上调，表明此信号通路被激活。本实验中，随感染程度的加深，p-p38 MAPK、p-JNK、p-ERK1/2蛋白含量随之上升，表明此信号通路参与介导的促细胞凋亡信号在增强。而细胞生存能力实验却表明，随感染程度的加深，DCs的生存状况反而较优。原因可能EV71感染后机体由于应激反应，DCs细胞趋向成熟，以刺激T细胞对抗病毒。DCs对初始T细胞的增殖活化起关键作用，因此随感染程度的加深细胞死亡及凋亡率降低，这是机体抵御病毒感染的自然反应。EV71感染未成熟DCs激活细胞凋亡信号通路，但由于本研究是将已被病毒感染患儿的单核细胞提出体外诱导培养，未成熟的DCs在体外无持续病毒感染情况下被诱导成熟，因此导致虽然信号通路开启，但细胞凋亡及死亡率降低。

综上所述， EV71感染可促进DCs成熟并分泌细胞因子，同时抑制其凋亡，活化MAPK信号通路，上调炎性细胞因子表达。

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