李伟达，邓乐君，李健，万华印，李茹冰

(1广东药科大学中药学院，广州510006；2广州军区广州总医院；3南方医科大学；4广州市拜特凇医药科技有限公司)

猪源纤维蛋白贴的黏附性及其对犬肝中叶及大鼠股动脉出血的止血效果

李伟达1,2，邓乐君1,3，李健1，万华印4，李茹冰1,2

(1广东药科大学中药学院，广州510006；2广州军区广州总医院；3南方医科大学；4广州市拜特凇医药科技有限公司)

目的 探讨猪源纤维蛋白贴(DBT)的黏附性及对肝脏和股动脉出血创面的止血作用。方法 使用胶带初黏性试验机测试DBT和胶原蛋白的初黏性；选用健康Beagle犬24只，随机分成模型对照组、医用胶原蛋白组和DBT组，建立犬肝脏出血创面模型，DBT组和医用胶原蛋白组分别贴上DBT、医用胶原蛋白，模型对照组直接用已称重的纱布轻放于肝脏切口上，比较三组的出血时间和出血量，此外模型对照组和DBT组动物术前1周、术后2 d、3周、13周用负压管从小隐静脉取静脉血2 mL，作凝血功能(PT、APTT、FIB)检测。选用SD大鼠40只，随机分为假手术组、纱布对照组、医用胶原蛋白组和DBT组，建立大鼠股动脉出血创面模型，DBT组和医用胶原蛋白组分别用DBT、医用胶原蛋白海绵包住动脉切口，纱布对照组则直接用已称重纱布块止血；假手术组只游离出股动脉，即刻缝合。比较四组的出血时间和出血量，计算止血成功率和再渗血率；同时观察大鼠术后4周的创面恢复情况。结果 DBT的黏附性明显优于胶原蛋白(P<0.01)；DBT组较模型对照组、医用胶原蛋白组犬肝脏出血时间及出血量明显减少(P均<0.01)，DBT组犬凝血功能未见明显影响，术后13周能降解吸收完全，不影响创面的恢复。DBT组较纱布对照组、医用胶原蛋白组大鼠出血时间及出血量明显减少(P均<0.01)，大鼠的再渗血率降低；DBT组术后4周创面大部分将其降解、吸收。结论 猪源纤维蛋白贴黏附性较好，对犬肝脏和大鼠股动脉出血创面的止血效果较好，可降解吸收，且未对机体凝血功能造成影响。

肝脏出血；股动脉出血；纤维蛋白贴；止血效果；止血生物制品

出血是交通事故和外科手术治疗中最常见的问题，尤其是肝脏等重要脏器的破裂出血可直接威胁生命[1]。目前，可吸收生物止血材料因其低抗原性、可降解性和良好的生物相容性等特点在医用止血领域中日益受到关注。其中纤维蛋白类止血物是模拟人体凝血机理在创面形成网状胶防止渗血，已从医疗器械转为生物制品类药物。本试验使用的猪源纤维蛋白贴(DBT)是采用无菌的方法采集猪血浆，从中提取纤维蛋白原和凝血酶，从猪跟腱中提取胶原蛋白，最终与猪源性胶原蛋白一同冻干成海绵制剂。2016年4月，我们检测了DBT的黏附性及对动物肝脏创面和股动脉切口的止血作用，并与临床常用的医用胶原蛋白海绵进行比较，为该类止血材料的研发提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料 Beagle犬，普通级，雌雄不限，体质量7.0～9.0 kg，8～10月龄，24只(高要市康达实验动物科技有限公司)。SD大鼠，SPF级，雌雄不限，体质量200～220 g，6～8周龄，40只(广州中医药实验动物中心)。DBT[规格：(10×5×0.5) cm(广州市拜特凇医药科技有限公司，批号20140606)，样品-25 ℃保存]。猪源胶原蛋白海绵(DBM)，规格：(10×5×0.5)cm(广州市拜特凇医药科技有限公司，批号20141226)。医用胶原蛋白海绵，规格：(12×8×0.5)cm(无锡贝迪生物工程有限公司，批号20140407)。戊巴比妥钠(Sigma)。10%水合氯醛(广州军区广州总医院)。注射用头孢呋锌钠(山东罗欣药业股份有限公司)。痛立定(法国威隆)。胶带初黏性试验机：东莞博莱德仪器设备有限公司。剃毛器：松下儿童理发器，ER353A。电子天平：METTLER TOLEDO，PL403。血凝分析仪：Beckman Coulter，ACL7000。

1.2 初黏性测试 取受试样品DBT、DBM和医用胶原蛋白海绵置于倾斜角为30 °的胶带初黏性试验机倾斜板中央，测试样品的贴敷面朝上，斜面上部10 cm及下部15 cm用0.5 cm厚的塑料板覆盖，中间留出5 cm的测试样品面，并均匀喷洒1 mL生理盐水，3 min后将6号钢球自斜面顶端自由滚下，测试钢球能否黏在样品上，若能，则计为合格，统计合格率，并记录钢球在样品上滚过的距离。

1.3 Beagle犬肝脏创面止血试验 选用健康Beagle犬24只，随机分成模型对照组、医用胶原蛋白组和DBT组，每组8只。用3%戊巴比妥钠静脉注射(1 mL/kg)麻醉，上腹部剃毛，并进行常规消毒，于上腹沿正中线切开表皮(约8 cm)、肌层和腹膜，撑开手术口，暴露肝脏，将其肝中叶游离于垫有润湿的灭菌纱布块上。接着用病理切片刀在肝脏表面切除一层8 cm×3.5 cm的组织，纱布按压创面1 min，DBT组和医用胶原蛋白组分别迅速贴上DBT、医用胶原蛋白，再用经称重的无菌纱布块轻轻按压创口，模型对照组直接用已称重的纱布轻放在肝脏切口。记录止血时间，计算出血量。止血后肝脏复位，分别缝合肌层和皮肤。连续3 d静脉注射头孢呋辛钠0.75 g/d，肌注痛立定1 mL/d，连续2 d。此外模型对照组和DBT组动物术前1周、术后2 d、3周、13周用负压管从小隐静脉取静脉血2 mL，作凝血功能(PT、APTT、FIB)检测。于术后3、13周各组分别取4只Beagle犬开腹检查腹腔内黏连和肝脏创面情况。

1.4 SD大鼠股动脉切口止血试验 选用SD大鼠40只，随机分为假手术组、纱布对照组、医用胶原蛋白组和DBT组，每组10只。大鼠腹腔注射10%水合氯醛0.35 mL/100 g，麻醉成功后，固定、腹股沟去毛、常规消毒，沿左侧腹股沟切开表皮并钝性游离出股动脉，近心端穿一细线，牵拉细线将动脉提起，用手术刀片于动脉上横向切割制造约1/2的切口。松开细线，让其自由出血5 s，DBT组和医用胶原蛋白组分别用DBT、医用胶原蛋白海绵包住动脉切口，再用已称重的纱布块按压30 s，观察出血情况，纱布对照组则以同样方法直接用已称重纱布块止血。记录出血时间，出血量统计方法同1.3。止血成功后3 min，最大限度屈伸左侧髋关节、膝关节20次，探查止血材料是否脱离或创面渗血，并记录。若10 min止血无效，则用细线结扎股动脉近心端。止血后，简单缝合关闭腹股沟创口，假手术组大鼠只游离出股动脉，即刻缝合。4周后，再对大鼠右侧股动脉进行同样的止血试验，之后解剖观察左侧腹股沟药物的降解情况。

2 结果

2.1 初黏性测试结果比较 医用胶原蛋白和DBM钢球均滚出样品外；而DBT样品均能黏到钢球，医用胶原蛋白、DBM、 DBT钢球停住位置的平均距离分别为>5 cm、>5 cm、(2.40±0.49)cm，医用胶原蛋白、DBM与 DBT比较，P均<0.01。

2.2 Beagle犬肝脏创面止血效果比较 模型对照组、DBT组与医用胶原蛋白组Beagle犬出血时间分别为(517.5±192.3)、(15.2±9.4)、(12.5±2.0)s, 出血量分别为(53.8±39.9)、(3.2±1.7)、(2.6±1.3)mL，模型对照组与DBT组及医用胶原蛋白组出血时间和出血量比较，P均<0.01；DBT组与医用胶原蛋白组出血时间和出血量比较，P均>0.05。术后2 d、3周、13周，各组动物的PT、APTT、FIB与自身术前1周比较差异均无统计学意义(P均>0.05)，各组间PT、APTT、FIB亦未见统计学差异(P均>0.05)，见表1。术后3周大体解剖观察，各组Beagle犬均无感染肿块，创面基本愈合，肝叶有白色透明膜，DBT组可见2例动物有药物残留，各组动物均有不同程度的肝叶间黏连(或与脂肪黏连)情况；术后13周，DBT和医用胶原蛋白基本降解吸收完全，无肉眼可见残留物，各组动物的黏连面积和程度均有下降，黏连情况无明显差别。

表1 模型对照组与DBT组不同时点的PT、APTT、FIB水平比较(±s)

2.3 SD大鼠股动脉切割止血效果比较 假手术组、出血不止，直至血管扁平，血液凝固。纱布对照组、医用胶原蛋白组和DBT组出血时间分别为(226.5±56.0)、(36.0±15.7)、(30.0±0.0)s,出血量分别为(0.56±0.21)、(0.12±0.07)、(0.11±0.10)mL，与纱布对照组比较，DBT组和医用胶原蛋白组出血时间和出血量差异有统计学意义(P均<0.01)。纱布对照组、医用胶原蛋白组和DBT组3 min内的止血成功率分别为45%、100%、100%，再渗血率分别为50%、5%、0%。术后4周左侧股动脉创面观察，各组动脉均无创口渗血，无明显炎症肿块出现，部分动物创面可见乳白色透明膜(纱布对照组2例、医用胶原蛋白组5例、DBT组2例)。DBT组有2例动物创面附近见芝麻大小淡黄色异物，疑似药物残留。

3 讨论

纤维蛋白类止血材料的机理是模拟正常人体内凝血的最后反应阶段，即纤维蛋白原在Ca2+与凝血酶的催化下形成纤维蛋白单体，凝血酶还能激活凝血因子ⅩⅢ成ⅩⅢa，使纤维蛋白单体相互结合成不溶性纤维蛋白多聚体[2～4]。作为外源性的止血胶，其并不依赖于机体的凝血成分，可用于正在服用抗凝药物或有凝血功能障碍者。

本研究中应用的DBT是一种新型纤维蛋白止血材料，国内暂无相同产品。以猪源性作为制剂成分，能大大降低该类产品的成本；而猪血浆来源亦是用无菌的采血装置采集(专利申请号：201520170962.1)，相对屠宰式猪血采集大大减少了污染的概率。该DBT制剂的纤维蛋白原面与创面少量血液接触后，纤维蛋白原与凝血酶即可快速反应形成纤维蛋白网，数秒内DBT黏附创面而达到止血作用。胶原蛋白层则为按压面，有效地阻拦冲破纤维蛋白多聚体的渗血，同时已有报道表明胶原蛋白能吸附血小板，诱导血小板激活发生聚集，形成血小板聚集物[5,6]。这样纤维蛋白层与胶原蛋白层双重阻挡创面的渗血，实现生化与机械止血相结合[7]，可提高止血效果。

初黏性指黏合剂在黏合作用初期的黏接性，采用斜面滚球法的原理，通过能黏住的最大钢球号来表征制品的初黏性能。测试中以喷洒生理盐水模拟血液与止血材料接触，并以DBT能黏住的6号钢球测试。本研究结果显示，DBT遇液体后的体外黏附性明显优于医用胶原蛋白海绵。动物实验中，DBT与医用胶原蛋白海绵均能明显降低Beagle犬肝脏和大鼠股动脉切口创面的出血量、缩短止血时间，且在肝脏和股动脉创面出血实验中DBT组的平均出血时间和出血量均较医用胶原蛋白海绵组少。已上市的医用胶原蛋白海绵与创面的黏合力稍差；而多成分冻干的DBT贴片能更好地吸收血液，并与创面紧密结合，体外测试亦证明了二者的黏性效果差异。因此，DBT更能降低材料滑落或移位的风险，尤其在股动脉止血时，由于胶原蛋白的黏合力不强，且腹股沟处使用的止血材料较少，在包合动脉、纱块按压过程中，胶原蛋白易与纱布块黏连，有时需更换新的胶原蛋白贴再次按压方能止血，使得DBT在控制止血时间和出血量上略优于胶原蛋白海绵。此外，针对出血迅猛的创面，黏合力强的DBT更有利于叠加使用。

从试验的止血时间看，DBT对犬的肝脏创面相比大鼠股动脉切口止血速度快，是因为实验设计的区别导致。对于大创口渗血，接触面积大，必须纱布按压1 min对渗血量进行控制，再贴敷止血材料才能有效封闭创面。但鉴于大鼠股动脉较细，按压过久易造成血管口暂时堵塞，不易对比观察，在切割动脉时亦是选择了细线提起而非止血钳夹闭。提示该制剂临床应用时，对大面积的渗血创面应先用纱布块按压止血，让细微血管收缩后，再施以药物加压贴敷；对大血管的急性出血应在缝合后再包合该药物以防渗血。本实验结果显示，DBT未引起犬的全身性凝血抗凝平衡失常。在犬和大鼠术后解剖检查中，DBT不会对动物创面发生感染肿块情况；提示DBT给药量较大时，3～4周不能保证DBT成分能被机体降解完全；而在犬的肝创面术后13周可判断DBT已降解吸收完全，无肉眼可见明显异物。各组术后均有不同程度的黏连，但差异无统计学意义。黏连应为动物的机体自我修复过程，黏连程度亦随术后时间延长而减弱。理论上，DBT的外层为胶原蛋白层，曾有报道胶原蛋白具有防黏连的效果，但若要确定DBT是否有致组织黏连或防黏连效果，则仍需进一步设计相关实验研究。

上述实验研究结果表明DBT海绵贴具有良好的止血效果，在体内可吸收降解，使用方便。

[1] 黄远铿,肖百全,欧慧瑜,等.新型止血材料纤维蛋白贴的止血作用研究[J].中国药理学通报,2013,29(8):1140-1145.

[2] Gupta N, Chetter I, Hayes P, et al. Randomized trial of a dry-powder, fibrin sealant in vascular procedures[J]. J Vasc Surg, 2015,62(5):1288-1295.

[3] 张送达.浅谈止血药凝血酶的研究进展[J].中国医药指南,2013,11(16):98-99.

[4] Rosselli DD, Brainard BM, Schmiedt CW. Efficacy of a topical bovine-derived thrombin solution as a hemostatic agent in a rodent model of hepatic injury[J]. Can J Vet Res, 2015,79(4):303-308.

[5] Shoulders MD, Raines RT. Collagen structure and stability[J]. Annu Rev Biochem, 2009,78:929-958.

[6] Qerimi B, Baumann P, Hüsing J, et al. Collagen hemostat significantly reduces time to hemostasis compared with cellulose: COBBANA, a single-center, randomized trial[J]. Am J Surg, 2013,205(6):636-641.

[7] 赵士海,胡庆柳,钟志勇,等.胶原/纤维蛋白止血效果观察[J].中国比较医学杂志,2010,20(5):61-65.

广州市科技计划项目(201509010012)；重大新药创制项目(2013ZX09J13110)。

李茹冰(E-mail:lrb90927@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.09.009

R605.972

A

1002-266X(2017)09-0031-03

2016-11-17)