张 鑫 郝玉琴



·论著·

不同剂量ALA-PDT对皮肤鳞状细胞癌A431细胞增殖的抑制作用

张 鑫1,2郝玉琴1

目的： 确定5-氨基酮戊酸-光动力疗法对皮肤鳞状细胞癌A431细胞抑制的最佳剂量。方法： 体外培养人皮肤鳞状细胞癌A431细胞株，应用MTT法检测不同ALA浓度(0.5、1、2 mmol/L)、不同PDT光照剂量(5、10、20、40 J/cm2)下A431细胞的增殖水平。结果： 当ALA浓度为0.5 mmol/L时，光照剂量为5、10、20、40 J/cm2对A431细胞的抑制率分别为6%、10%、15%、18%；当ALA浓度为1 mmol/L时，光照剂量为5、10、20、40 J/cm2对A431细胞的抑制率分别为30%、52%、80%、82%；当ALA浓度为2 mmol/L时，光照剂量为5、10、20、40 J/cm2对A431细胞的抑制率分别为31%、54%、81%、82%。结论： ALA在浓度为1 mmol/L,光照剂量为20 J/cm2时，ALA-PDT对A431细胞增殖抑制效果达到最佳。

ALA-PDT； 皮肤鳞状细胞癌； A431细胞； 增殖

皮肤鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma, SCC)是皮肤癌中常见恶性肿瘤，发病率逐年升高。SCC的治疗方法很多，ALA-PDT是继手术、放疗、化疗等传统疗法后,近二十年发展起来的新疗法,由光敏剂受光活化形成活性氧，进而导致细胞受损甚至死亡,是一种基于光敏剂光毒性反应的新的治疗方法[1]。ALA-PDT在临床治疗肿瘤中已取得了令人瞩目的成就，ALA-PDT最突出的优势是准确定位靶组织，可选择性杀死肿瘤细胞而对邻近的正常组织影响较小。与手术、化疗、放疗等传统治疗手段相比，PDT创伤小、毒性低，兼具美容效果[2,3]，在肿瘤治疗中具有不可替代的优点。尽管ALA-PDT已在临床使用，但关于其基础研究，各学者的实验研究的作用剂量有很大出入。因此本实验应用不同浓度ALA、光照剂量来观察ALA-PDT对鳞癌A431细胞的作用效果，旨在为ALA-PDT用于细胞等基础研究提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 仪器及试剂 实验仪器及试剂：ALA为Sigma公司产品；胎牛血清、DMEM高糖培养基、胰酶为Invitrogen公司产品；四甲基偶氮唑蓝(MTT)为Sigma公司产品；96孔反应板为德国Roche公司产品；酶标仪为Thermo Labsystems公司产品；红光光照仪为普门公司产品。

1.2 细胞培养 人A431皮肤鳞癌细胞株(由长沙赢润生物技术有限公司提供)贴壁培养于DMEM(高糖型)完全培养基(含10%小牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素)中，置37℃、饱和湿度、5% CO2的培养箱内培养，每1～2 d换液一次，细胞单层贴壁生长，待长满瓶底时，用0.25%胰蛋白酶消化液消化成单个细胞，取对数生长期的细胞准备实验。

1.3 实验分组 空白对照组:无光敏剂未光照组;光照对照组：仅照光无光敏剂;药物对照组：仅加药未光照; ALA-PDT组:不同ALA浓度+不同光照剂量。

1.4 细胞PDT处理 取处于对数生长期、生长状态良好的A431细胞以每孔104个细胞接种于96孔培养板中，每孔培养基体积200 μL。待A431细胞贴壁24 h后，进行上述干预。ALA的浓度分别为:0、0.5、1、2 mmol/L；ALA避光孵育时间:4 h；光照剂量:红光仪，波长635 nm，功率密度为18 mW/cm2，光斑距96孔板5 cm处垂直照射，治疗光斑完全覆盖实验细胞，光照能量密度分别为：5、10、20、40 J/cm2。药物对照组：ALA 1 mmol/L,严格避光。干预后立即更换新鲜培养基继续培养24 h后进行MTT检测。每组平行3个复孔，实验重复3次。

1.5 MTT比色法检测细胞体外增殖活力 各组细胞在检测时间点时，每孔加20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，在37℃、5% CO2培养箱中培养4 h，小心吸弃孔内培养上清液，避免吸去紫色结晶。

每孔加150 μL DMSO，振荡10 min，使结晶物充分溶解。

选择490 nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值OD，记录结果，以未加药细胞组作为空白对照组，计算细胞增殖抑制率/存活率，抑制率(IP)=(1-药物组OD/对照组OD)×100%；存活率=药物组OD/对照组OD×100%。对照组存活率为100%，

1.6 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件进行处理。所有数据均以均数±标准差表示，采用方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 单独照光及单独加药对细胞并无增殖抑制作用。

2.2 不同浓度ALA和不同光照剂量对A431细胞的增殖抑制率影响 见表1，图1。当ALA浓度为0.5 mmol/L时，光照剂量为5、10、20、40 J/cm2对A431细胞的抑制率分别为6%、10%、15%、18%；当ALA浓度为1 mmol/L时，光照剂量为5、10、20、40 J/cm2对A431细胞的抑制率分别为30%、52%、80%、82%；当ALA浓度为2 mmol/L时，光照剂量为5、10、20、40 J/cm2，对A431细胞的抑制率分别为31%、54%、81%、82%。

表1 不同浓度ALA和不同光照剂量对A431细胞抑制率影响

注：*与对照组比较P<0.05

图1 不同浓度ALA和不同光照剂量对A431细胞抑制率影响

2.3 当ALA浓度为1 mmol/L与2 mmol/L对A431细胞抑制作用效果明显，二者间的作用效果差异不大；A431细胞抑制率随光照剂量的增加而增加，在20～40 J/cm2内增加不明显。

3 讨论

SCC是皮肤科常见恶性肿瘤，发病率逐渐增高。目前的治疗方法包括手术切除(Mohs手术)、冷冻疗法 、电灼烧、局部治疗(5-氟脲嘧啶和咪喹莫特)、放射治疗等。对于大面积、特殊部位(面部、外生殖器)以及多灶性病变的SCC，这些方法疗效不佳，而且容易形成疤痕。此外，这些疗法所具有的美容效果非常有限，难以满足人们对良好外观的要求。PDT是近20年来兴起并不断发展的一项肿瘤治疗新技术，在临床治疗肿瘤中已取得了令人瞩目的成就，由于皮肤病损组织的照光容易实现，PDT在皮肤科的应用是比较活跃的研究课题[4-6]。PDT作为一种新疗法，具有良好的组织选择性，不破坏正常细胞且不受皮损位置及大小的限制，成为目前临床治疗SCC等增殖性疾病使用越来越多的手段。

ALA-PDT虽然已经应用于临床，但有关其基础研究的实验作用剂量各研究者有很大出入，如乔丽等[7]关于ALA-PDT对皮肤鳞癌A431的增殖研究时采用的ALA为0.4 mg/mL,功率密度10 mW/cm2，能量密度2.5 J/cm2。刘园园等[8]研究发现ALA浓度为3.2 mmol/L、光照剂量为80 J/cm2时，ALA-PDT对皮肤鳞癌A431细胞的抑制作用达最佳。张秀娟等[9]研究ALA-PDT对人皮肤鳞癌SCL-1细胞的杀伤作用是采用ALA浓度为40 μg/mL，功率密度230 mW/cm2。其中能量密度、功率密度、照光时间是照光的三大参数，三者之间的换算公式：照光时间(S)=能量密度(J/cm2)/功率密度(W/cm2)。

本实验应用不同浓度ALA、光照剂量来观察ALA-PDT对鳞状细胞癌A431细胞的抑制作用，旨在为ALA-PDT用于细胞等基础研究提供实验剂量依据。为明确ALA-PDT对人皮肤鳞状细胞癌细胞的增殖抑制的最佳作用剂量，我们釆用MTT法进行检测，发现单独用药和单独照光对细胞生长基本无影响。在相同的培养时间和ALA浓度下，随着光照剂量递增细胞抑制率呈上升趋势，但在20～40 J/cm2这两个光照剂量之间，细胞抑制率上升不明显，各ALA浓度组在20～40 J/cm2这两个光照剂量之间，细胞抑制率差异无显著性(均P>0.05)，杀伤作用进入平台期。提示并非光照剂量越高对细胞杀伤越强。同时，培养时间和光照剂量相同时，ALA浓度为1 mmol/L、2 mmol/L与ALA浓度为0.5 mmol/L相比，不同光照剂量对A431细胞抑制率差异有显著性(均P<0.05)，而ALA浓度为1 mmol/L与2 mmol/L时，不同光照剂量对A431细胞生长抑制率差异无显著性(均P>0.05)。

本实验结果提示，对于体外培养人皮肤鳞状细胞癌A431细胞，ALA在浓度为1 mmol/L,光照剂量为10 J/cm2时，A431细胞抑制率为52%；ALA在浓度为1 mmol/L,光照剂量为20 J/cm2时，A431细胞抑制率为82%，ALA-PDT的杀伤作用最佳。

[1] Darlenski R, Fluhr JW. Photodynamic therapy in dermatology: past, present, and future[J]. J Biomed Opt,2013,18(6):1208.

[2] Lee Y, Baron ED. Photodynamic therapy: current evidence and applications in dermatology[J]. Sem in Cutan Med Surg,2011,30(4):199-209.

[3] Shirasu N, Nam SO, Kuroki M. Tumor-targeted photodynamic therapy[J]. Anticancer Res,2013,33(7):2823-2831.

[4] Qing YG, Zhang XP, Li J, et al. Photodynamic therapy for malignant and non-malignant diseases: clinical investigation and application[J]. Chin Med J(Engl),2006,119(10):845-857.

[5] Braathen LR, Szeimies RM, Basset-Seguin N, et al. Guidelines on the use of photodynamic therapy for nonmelanoma skin cancer: an international consensus. International society for photodynamic therapy in dermatology,2005[J]. J Am Acad Dermatol,2007,56(1):125-143.

[6] MacCormack MA. Photodynamic therapy in dermatology: an update on applications and outcomes[J]. Semin Cutan Med surg,2008,27(1):52-62.

[7] 乔丽,杨志勇,许成山,等.光动力学疗法对皮肤鳞状细胞癌A431细胞增殖及细胞周期的影响[J].山西医科大学学报,2016,47(1):51-54.

[8] 刘园园,王逸飞,张春敏,等.ALA-PDT对皮肤鳞状细胞癌A431细胞Caspase-3及Caspase-7表达的影响[J].山东大学学报,2014,52(12):50-53.

[9] 张秀娟,焦亚宁,刘建平,等.细胞外信号调节激酶在5-氨基酮戊酸光动力疗法杀伤SCL-1细胞中的作用[J].中国皮肤性病学杂志,2013,27(5):435-439.

(收稿：2016-09-05 修回：2016-10-28)

《中国皮肤性病学书目提要及著者传略》征文及研修班招生

为了系统总结我国皮肤性病学文献及介绍做出重要贡献的著者，廖万清院士、禤国维国医大师领衔编辑《中国皮肤性病学书目提要及著者传略》。本书将编辑4000多种皮肤性病学书目提要，1000多名著者传略。凡为本书提供书目及著者传略者、向筹建的中国皮肤科博物馆赠送文物者，可获赠《中国皮肤科学史》(600元)l册。

为推动、推进、推广我国外用中药临方调剂，实现每个单位均有外用中药临方调剂室、人人会配制外用中药的局面，2017年继续举办全国皮肤美容化妆品制剂研修班，传授实用处方，示教实习，学会为止。报名注册者获赠《皮肤美容化妆品制剂手册》(68元)和《皮肤病中医方剂制剂手册》(70元)各1册。赠送临方调配乳膏基质及其他药品试用。对索取征文及招生信息和获取试用药品者，来函必复。

陕西马振友药业有限公司 手机/微信：13379033002；QQ:386966727

Inhibition of ALA-PDT on A431 cells in cutaneous squamous cell carcinoma

ZHANGXin1,2,HAOYuqin1.

1.DepartmentofDermatology,theThirdAffiliatedHospital,InnerMongoliaMedicalUniversity,Baotou014010,China; 2.GraduateStudentinInnerMongoliaMedicalUniversity,Hohehot010010,ChinaCorrespondingauthor:HAOYuqin,E-mail:haoyuqin0472@163.com

Objective: To determine the optimal dose of ALA-PDT on the inhibition of A431 cells proliferation in cutaneous squamous cell carcinoma. Methods: A431 cells were cultured firstlyinvitro, and then, were treated with different drug concentration (0.5, 1 and 2 mmol/L) and different dose of PDT (5, 10, 20 and 40 J/cm2). The proliferation of treated A431 cells was detected by MTT. Results: The inhibition rates of A431 cells treated under the condition of 0.5 mmol/L ALA combined with 5, 10, 20 and 40 J/cm2PDT were 6%, 10%, 15% and 18% respectively. The inhibition rates of A431 cells treated with 1 mmol/L ALA combined with PDT of 5, 10, 20 and 40 J/cm2PDT were 30%, 52%, 80% and 82% respectively. The inhibition rates of A431 cells treated with 2 mmol/L ALA combined with 5, 10, 20 and 40 J/cm2PDT were 31%, 54%, 81% and 82% respectively. Conclusion: The highest inhibition rate of PDT on A431 cell proliferation is 1mmol/L ALA and 20 J/cm2PDT.

ALA-PDT; cutaneous squamous cell carcinoma; A431 cell; proliferation

内蒙古自治区自然科学基金(编号：2014MS0895)

1内蒙古医科大学第三附属医院(内蒙古包钢医院)皮肤科，包头市，014010

2内蒙古医科大学在读研究生，呼和浩特，010000

郝玉琴，E-mail: haoyuqin0472@163.com