田 强,王 君,张梦娜,马 林,2,*,贺新生,2,袁小红,2

(1.西南科技大学生命科学与工程学院,四川绵阳 621010; 2.四川省生物质资源利用与改性工程技术研究中心，四川绵阳 621010)

薛凡尼氏炭角菌发酵菌丝体提取物的抗氧化活性

田 强1,王 君1,张梦娜1,马 林1,2,*,贺新生1,2,袁小红1,2

(1.西南科技大学生命科学与工程学院,四川绵阳 621010; 2.四川省生物质资源利用与改性工程技术研究中心，四川绵阳 621010)

分别采用4种不同溶剂(乙醇、甲醇、丙酮和水)对薛凡尼氏炭角菌菌丝体进行提取,测定不同溶剂提取物的总酚和总黄酮含量以及对DPPH自由基清除能力和总还原力。结果表明,不同溶剂提取物均具有不同程度的抗氧化活性。在各提取物浓度为2.5 mg/mL时,对DPPH自由基的清除率以水提物为最高(91.8%),其次为60%丙酮提取物和70%乙醇提取物,清除率分别为89.6%和83.6%,甲醇提取物的清除率最低(75.1%)。各溶剂提取物的还原能力强弱依次为:水>60%乙醇>70%乙醇>60%丙酮>甲醇。菌丝体水提物的总酚含量最高,而总黄酮含量最高的是甲醇提取物。总体而言,薛凡尼氏炭角菌菌丝体水提物具有较强的抗氧化活性,可能具有开发为食品抗氧化剂的潜力。

薛凡尼氏炭角菌,菌丝体,抗氧化,自由基清除,总还原力

从天然产物中寻找抗氧化活性物质,用于延缓衰老以及治疗与衰老有关的疾病,具有十分重要的意义。国内外已对100多种大型真菌进行了抗氧化活性研究,表明高等真菌是开发抗氧化物质的重要资源[1]。炭角菌属(Xylaria)真菌在中国已有悠久的药用历史,迄今为止,已从炭角菌属真菌子实体或发酵产物中分离获得多种活性化合物,其主要药用功能包括抗肿瘤、抗菌、抗氧化、抗病毒和增强机体免疫力等[2-4]。在抗氧化活性研究方面,吴根福等从炭角菌发酵菌粉中分离到12个纯度较高的抗氧化性物质,其中5个化合物的抗氧化活性与维生素E相近或更强[5]。龚庆芳等从黑柄炭角菌发酵菌丝体分离得到一个酚羟基类化合物,即1-(2,6-二羟基苯)-3-羟基-丁酮,表现出较强的DPPH自由基清除能力和还原力[6]。还有报道,其它炭角菌菌丝体的甲醇提取物以及分离的多肽和多糖均显示了较好的抗氧化活性[7-9]。薛凡尼氏炭角菌(Xylariaschweinitzii)为本课题组从竹桩采集分离获得,已对其进行了液体培养和子实体培养[10]。本文报道薛凡尼氏碳角菌发酵菌丝体不同溶剂提取物抗氧化活性,通过对其抗氧化活性的测定研究其是否具有开发为食品抗氧化剂的潜力。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

炭角菌菌种 由本课题组采集自四川省成都市邛崃芦沟竹海的慈竹桩,经分离纯化后获得纯菌种,由作者之一贺新生教授鉴定为薛凡尼氏炭角菌[11](XylariaschweinitziiBerk. & M.A.,异名SphaeriascruposaFr. 1828),菌种保藏在西南科技大学生命科学与工程学院微生物实验室(标本编号为20130808)。

DPPH 日本东京化成株式会社产品,纯度≥97%;芦丁标准品 成都普斯生物科技有限公司,纯度≥98%;甲醇、乙醇、丙酮、三氯乙酸、铁氰化钾、三氯化铁、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、亚硝酸钠、碳酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、维生素C和没食子酸等均为分析纯，蒸馏水。

HZQ-160F全温振荡培养箱 上海齐欣科学仪器有限公司;RE-52AA旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂;752紫外可见光分光光度计 上海佑科仪器仪表有限公司。

1.2 炭角菌液体培养

菌种活化:将4 ℃保存的薛凡尼氏炭角菌菌种接种到PDA培养基平板进行活化,在28 ℃培养5 d。

培养基制备:按马铃薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、蛋白胨1 g/L、磷酸二氢钾3 g/L和硫酸镁5 g/L配制培养基,pH自然。121 ℃灭菌30 min。

接种与培养:已活化菌种用直径6 mm打孔器取两块菌饼接入到250 mL三角瓶中,培养基装量为100 mL,共培养5 L。摇床转速120 r/min,培养温度28 ℃,培养7 d。

1.3 菌丝体提取

培养结束后将发酵培养液过滤,菌丝体用去离子水充分洗涤,晾干水分后在60 ℃充分干燥并粉碎。称取2 g干燥菌粉共5份,分别用15倍体积的60%乙醇、70%乙醇、100%甲醇、60%丙酮和蒸馏水在60 ℃条件下提取2 h。过滤后滤渣再用相应溶剂分别提取2次,合并提取滤液。将滤液在55 ℃减压蒸发出大部分的溶剂,转移至小烧杯中,在60 ℃水浴锅中使溶剂完全蒸干,称重并计算提取物得率。将获得的不同溶剂浸膏均用50%乙醇溶解,配制成10 mg/mL的溶液,置于4 ℃保存备用。

提取物得率按下面公式进行计算:

提取物得率(%)=[(M1-M2)/M]×100

式(1)

式(1)中，M1为蒸干后浸膏与小烧杯的质量(g);M2为小烧杯的质量(g);M为测试的样品粉末的质量(g)。

1.4 DPPH自由基清除活性测定

DPPH自由基清除活性测定参照文献[12]方法并略作修改。取待测样品1.5 mL加入到具塞试管中,再加入4.5 mL用甲醇溶解的DPPH溶液(0.1 mmol/L),混匀,37 ℃避光静置30 min,以蒸馏水调零,在517 nm波长测定吸光度。以维生素C(VC)为阳性对照(0.5 mg/mL),以仅加DPPH溶液而不加样品作为空白对照。每个样品重复测定3次。

DPPH自由基清除率按下面公式进行计算:

清除率(%)=[(A0-A1)/A0]×100

式(2)

式(2)中，A0为未加样品的空白吸光值;A1为样品的吸光值。

1.5 还原力测定

还原力测定参照武守华等的方法并略作改动[7]。以VC作标准品。取VC标准液0.2 mL于试管,依次加入0.2 mol/L磷酸钠缓冲溶液1 mL(pH6.6)和10 mg/mL铁氰化钾溶液1 mL,混匀后置于50 ℃温浴30 min。再加入100 mg/mL三氯乙酸溶液1 mL,混匀后4000 r/min离心10 min。取2 mL上层液体,依次加入2 mL蒸馏水和1 mg/mL氯化铁溶液0.4 mL,混匀后放置10 min,在700 nm下测定吸光度。以VC浓度为横坐标(X),吸光度值为纵坐标(Y),绘制标准曲线,建立回归方程。用VC当量(mg/g菌丝体)表示样品还原力的大小。不同溶剂提取的样品分别取0.2 mL按同样方法进行测定,每个样品重复3次。以蒸馏水代替样品作对照调零。

1.6 总酚含量测定

总酚含量测定参照张燕等的方法作适当改进[13]。以没食子酸作标准品,配制不同浓度的没食子酸标准液。吸取标准液1 mL加入到10 mL 棕色容量瓶中,加入6 mL 蒸馏水,再加入 0.5 mL福林试剂,充分摇匀,再加入20%碳酸钠溶液2 mL,用蒸馏水定容至刻度,于55 ℃水浴处理1.5 h,冷却,于765 nm处测定吸光度。以吸光度对没食子酸浓度作图,建立标准曲线和回归方程。不同样品各取1 mL按同样方法进行测定,重复3次。以蒸馏水代替样品作对照调零。

1.7 总黄酮含量测定

总黄酮含量测定参照罗永会等的方法[14]。以芦丁作标准品,配制不同浓度的芦丁标准液,依次加入不同试剂进行反应,于510 nm处测定吸光度。以芦丁浓度为横坐标,吸光度值为纵坐标,建立标准曲线和回归方程。待测样品各取0.5 mL,加入50%乙醇1.5 mL混匀,后续再按测定芦丁标准液的方法进行,每个样品重复测定3次。

1.8 数据统计分析

2 结果与分析

2.1 菌丝体不同溶剂提取物的得率

表1 薛凡尼氏炭角菌菌丝体不同溶剂提取物得率Table 1 The yield rate of different solvent extracts from mycelium of X. schweinitzii

用不同溶剂提取菌丝体所得提取得率见表1。结果表明,用水作溶剂的提取物得率最高,为38.8%,其它几种溶剂提取物的得率比较接近,在23.3%至26.1%之间。

2.2 菌丝体不同溶剂提取物对DPPH自由基的清除能力

不同溶剂提取物及VC对DPPH自由基的清除率见表2。VC在0.5 mg/mL时的清除率达95.6%,菌丝体5种溶剂提取物在2.5 mg/mL浓度时,以水提物的清除率最高,为91.8%,甲醇提取物对DPPH自由基的清除率最低,仅为75.1%,极显著低于其它溶剂提取物。

2.3 菌丝体不同溶剂提取物的还原力

以VC浓度为横坐标,吸光度值为纵坐标建立标准曲线,求得回归方程为Y=2.1189X+0.0081(R2=0.9971),Y表示吸光度,X表示VC浓度,表明VC含量在0～0.25 mg/mL范围内与吸光度呈良好线性关系。

还原力测定结果见表2。VC当量值越大,还原力越强。各提取物的还原力由大到小依次为:水>60%乙醇提取物>70%乙醇提取物>60%丙酮提取物>甲醇提取物。其中水提物的还原力极显著高于其它几种提取物,甲醇提取物的还原力最低,70%乙醇提取物、60%乙醇和60%丙酮提取物的还原力无显著差异。

表2 不同溶剂提取物的DPPH自由基清除率和还原力Table 2 DPPH scavenging and reducing power of different extracts

注:结果表示为平均值±标准偏差,n=3。同列数据后的不同小写字母表示处理间差异达显著水平(p<0.05),不同大写字母表示处理间差异达极显著差异(p<0.01),表3同。

2.4 菌丝体不同溶剂提取物的总酚及总黄酮含量

不同溶剂提取物的总酚及总黄酮含量见表3。总酚含量测定以没食子酸作对照品建立标准曲线回归方程:Y=0.0557X+0.0025(R2=0.9958),没食子酸浓度在0～0.02 mg/mL范围内与吸光度呈良好线性关系。总黄酮含量测定以芦丁作对照品建立标准曲线回归方程:Y=0.0106X-0.0083(R2=0.9993),芦丁浓度在0～100 μg/mL范围内与吸光度呈良好线性关系。

由表3可知,不同溶剂提取物中总酚含量顺序为水提取物>甲醇提取物>60%乙醇提取物>70%乙醇提取物>60%丙酮提取物,其中70%乙醇提取物与60%丙酮总酚含量无显著差异,水提物的总酚含量最高(13.96 mg/g),极显著高于其它提取物,甲醇提取物的总酚含量仅次于水提物。

表3 不同溶剂提取物的总酚和总黄酮含量Table 3 Total phenols and total flavonoid of different extracts

甲醇提取物的总黄酮含量最高,其次为水提物,60%丙酮提取物的总黄酮含量最低,仅为5.80 mg/g,60%乙醇提取物与70%乙醇提取物总黄酮含量无显著差异。

表4 总酚及总黄酮含量与抗氧化活性的相关性Table 4 Correlation between total phenolic and total flavonoid content and antioxidant activity

注:*表示在0.05水平上显著相关,**表示在0.01水平上显著相关;表5同。

表5 含水提取物总酚及总黄酮含量与抗氧化活性的相关性Table 5 Correlation between total phenolics and total flavonoids content and antioxidant activity in aqueous extracts

2.5 总酚及总黄酮含量与抗氧化活性的相关性

将不同溶剂提取物的总酚及总黄酮含量分别与DPPH自由基清除率和总还原力作相关性分析。发现总酚含量与DPPH自由基清除率以及与总还原力的相关性较低,相关系数分别为0.233和0.340,而总黄酮含量与DPPH自由基清除率之间以及与总还原力之间均呈负相关,相关系数分别为0.613和0.681。当只考虑水提物及其它含水提取物(60%和70%乙醇提取物以及60%丙酮提取物)与抗氧化活性的相关性时,计算结果表明,含水提取物总酚含量及总黄酮含量均与总还原力呈显著相关,相关系数分别为0.987和0.862,而与DPPH自由基清除率的相关性相对较低(相关系数分别为0.559和0.276)。

3 讨论与结论

薛凡尼氏炭角菌菌丝体不同溶剂提取物在2.5 mg/mL浓度时对DPPH自由基均具有较好的清除效果(75.1%～91.8%),总还原力按VC当量计以水提物为最高,而甲醇提取物的总还原力最低,其它3种提取物的总还原力无显著差异。水提物相比其它溶剂提取物具有更好的抗氧化活性,这与其所含较高的总酚含量(13.96 mg/g)和总黄酮含量(16.53 mg/g)有关。已有研究表明,提取溶剂的极性对多酚类化合物的提取效率和提取物抗氧化活性有很大影响,如薄荷、红薯叶、翠云草和蓝莓叶等的水提物就含有更高的总酚(或多酚)含量[15-18],而甲醇提取物的总黄酮含量通常较高,本研究结果与此类似。除甲醇提取物外,薛凡尼氏炭角菌菌丝体水提物总黄酮含量也显著高于其它提取物,这种情况也有类似的报道[19-20]。

酚类化合物是天然植物提取物中具有抗氧化活性的主要物质基础,而黄酮类化合物是植物体内的含量最为丰富的酚类化合物,它们的含量高低与抗氧化活性具有明显的相关性,但这种相关性并不一致。如鱼腥草水提物的总酚和总黄酮含量最高,对DPPH自由基清除率和总还原力也最高[20],对桑叶和荔枝花的研究也发现，在甲醇、丙酮和水3种溶剂中，水提物的总酚、总黄酮含量及抗氧化活性均最低[21-22]。然而，对于红薯叶的研究却得到相反的结果，在7种提取溶剂中，水提物的总黄酮含量较低，仅高于氯仿提取物，但其对DPPH自由基清除率及还原力却较高，仅次于甲醇提取物[16]，这种情况可能与不同植物的化学成分存在较大差异有关。

高等真菌的抗氧化活性物质主要是多酚类、三联苯类、聚酮类、生物碱、萜类和甾体等化合物。李峻志等总结了2000年以来对35种大型真菌中的抗氧化活性物质研究结果,发现在分离鉴定的138个化合物中,含有多个羟基的多酚类(包括黄酮)和三联苯类化合物最多(92个),而且羟基越多,清除自由基的能力最强[1]。

本研究发现,含水的有机溶剂提取物对DPPH自由基清除率以及总还原力相对较高,表明极性较大的酚类物质可能是薛凡尼氏炭角菌中抗氧化活性的主要成分,龚庆芳等对黑柄炭角菌的研究结果也表明,主要是含有酚羟基的化合物起到了清除自由基的作用[6]。除酚类物质外,薛凡尼氏炭角菌菌丝体中可能还含有其它水溶性成分,如邵雪莲对痂状炭角菌进行液体培养,就发现其胞内及胞外多糖均具有清除DPPH自由基和氧阴离子自由基的能力[23]。

本研究结果表明,以水作为溶剂提取菌丝体相对于有机溶剂得到的提取物更多,并且测得水提物的抗氧化活性良好,活性成分含量较高,说明薛凡尼氏炭角菌水提物在用于开发抗氧化食品添加剂上具有一定的潜力且在加工安全性上有较好的保障,有必要对其活性成分进一步进行分离和鉴定。

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Antioxidant activities of different solvents extracts from mycelium ofXylariaschweinitziiin submerged culture

TIAN Qiang1,WANG Jun1,ZHANG Meng-na1,MA Lin1,2,*,HE Xin-sheng1,2,YUAN Xiao-hong1,2

(1.School of Life Science and Engineering,Southwest University of Science and Technology,Mianyang 621010,China; 2.Engineering Research Center for Biomass Resource Utilizaiton and Modification of Sichuan Province,Mianyang 621010,China)

Four different solvents(ethanol,methanol,acetone and water)were used for extracting the mycelium ofXylariaschweinitzii. The content of total phenolics and total flavonoids in the extracts from different solvents was analyzed and the scavenging capacity of DPPH radical scavenging capacity and total reducing power were determined. The results showed that the different solvent extracts had different antioxidant activity. At the concentration of each extract 2.5 mg/mL,the water extract showed the highest radical scavenging rate(91.8%)on DPPH,followed by 60% acetone extract and 70% ethanol extract,the scavenging rates were 89.6% and 83.6%,and the methanol extract showed the lowest scavenging rate which was(75.0%)on DPPH. The reduction ability of the different solvent extracts was in the order:water>60% ethanol>70% ethanol>60% acetone>methanol. The highest content of total phenolics was found in water extract,but the highest content of total flavonoids was in methanol extract. In conclusion,the antioxidant activity of the aqueous extracts from the mycelium ofXylariaschweinitziiwas significant,which probably has the potential to develop as a food antioxidant.

Xylariaschweinitzii;mycelium;antioxidation;free radical scavenging;total reducing power

2016-09-29

田强(1991-)，男，本科，研究方向：制药工程，E-mail:1296559811@qq.com。

*通讯作者:马林(1964-)，男，博士，教授，研究方向：天然产物化学，E-mail：malin@swust.edu.cn。

国家自然科学基金项目(21272189)；国家大学生创新创业训练计划(201410619002)。

TS201.2

A

1002-0306(2017)07-0049-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.07.001