陈梦杰，周军

(三峡大学第一临床医学院，湖北宜昌 443003)

超声分子成像在肿瘤新生血管评价中作用的研究进展

陈梦杰，周军

(三峡大学第一临床医学院，湖北宜昌 443003)

实体瘤的生长、侵袭和转移依赖于血管生成，对肿瘤血管的成像是早期诊断恶性肿瘤的重要途径，而血管生成与肿瘤组织内表达的分子物质(如血管内皮生长因子VEGFR-2、整合素αvβ3、共刺激分子B7-H3等)密切相关，这些分子可成为靶向超声造影剂的靶点，为肿瘤新生血管的显影提供条件。分子成像评价肿瘤新生血管的研究使人们对肿瘤血管生成有了进一步认识，此为肿瘤的临床诊断和治疗提供了新的可能研究方向。

肿瘤血管；靶向造影剂；超声分子成像

近年来，新超声分子靶向造影剂的出现使新兴超声分子成像技术呈现出巨大前景，引起研究者们的广泛关注。不同的抗原或受体分子会在病理过程中高水平表达，在正常组织中往往不表达或低水平表达，超声分子成像技术就是利用相应的亲和分子与微泡造影剂结合，使其主动结合至靶区并聚集，从而在分子水平观察疾病进程。超声分子成像技术不仅具有传统超声的优点，如高分辨率、低成本和无电离辐射等，而且结合了分子靶向超声造影剂，对分子靶点的定量评估具有高敏感性[1]。目前这一新兴技术较广泛用于肿瘤、血栓及炎症的显像研究中。血管生成在肿瘤发生发展过程中扮演重要角色，在肿瘤组织内特异性高表达的血管生成相关因子可作为肿瘤超声分子成像及肿瘤治疗的靶向作用位点。超声分子成像技术通过定量评估肿瘤新生血管生成情况来间接反映肿瘤组织增殖、转移及侵袭活性，且可实时动态观察,反复诊断。超声分子成像的多功能临床应用潜能使其成为超声分子影像学发展的热点。现对超声分子成像在肿瘤新生血管评价中作用的研究进展综述如下。

1 超声靶向造影剂的组成及特性

分子影像技术的关键在于分子探针选择，靶向超声造影剂作为新型的超声分子探针是目前研究热点。超声靶向造影剂的设计思路是将靶向分子的疾病特异性配体或抗体连接至微泡外壳，造影剂经静脉注射到达人体内各器官微循环后，依靠抗体、抗原或受体、配体的特异性结合主动与疾病高特异性分子结合，达到分子成像及定量分析疾病某一阶段特定分子标志物的目的[2]，这亦是超声影像学从非特异性成像到靶显像、从宏观形态到微观分子的转变。

1.1 靶向造影剂的组成 传统造影剂是由外层壳包裹气态芯组成，不同气体芯(如空气、氮气、全氟化碳或六氟化硫)和不同外壳(如清蛋白、半乳糖、脂质或高分子聚合物)组成不同类型造影剂。靶向造影剂是在传统微泡的基础上将特异性分子连接至微泡外壳表面，其制作过程极为复杂，大致分为两种连接方式，即共价连接与非供价连接。前者主要靠微泡与配体之间的离子键、物理吸附等作用，此方法稳定性不高，适用于小分子配体的连接；后者是利用生物素-亲和素等桥梁进行连接，结合效率高，尤其适用于不能耐受微泡制作过程的大分子单抗[3]。

1.2 靶向造影剂的特性及优势 在超声场作用下，造影剂内的气体芯经压缩和膨胀可产生有效背向散射，可被超声探头接收并经成像系统检测成像。造影剂经静脉注射到达人体内各器官微循环后，可使超声回波信号显著增强，从而大大提高超声诊断效果[4]。微米级造影剂可自由通过肺循环，但因自身大小的限制不能透过血管，不能对血管外疾病进行诊断和治疗，因此具有局限性。随着纳米技术及纳米材料的发展，新型纳米级造影剂的研发日益崛起，并凭借着其相对分子质量小、穿透力强等优点推动分子成像技术的发展。研究表明，肿瘤血管内皮间隙比正常血管内皮间隙大，能允许直径小于700 nm的粒子穿过，在7.5 MHz的频率下，粒径小至500 nm的微泡能产生有效造影效果[5]，这为纳米级超声造影剂用于血管外靶组织显像提供了理论依据。靶向造影剂是由普通造影剂与靶向分子结合而成,不但有传统造影剂的特性，且在靶向分子的引导下，造影剂可靶向到达某特定部位进行显影，从而显著提高超声诊断的效果。传统超声造影剂不能有效停留于病变组织，只能短暂地在病变组织内显影，因此对疾病的诊断欠佳，而靶向造影剂可延长造影剂在病变组织中的停留时间，使造影剂的增强效果相对持久。另外，将靶向造影剂与治疗药物或基因结合，可将治疗药物、基因定向地输送到某特定的病变组织，达到定向基因或药物治疗病变的目的。

2 肿瘤新生血管成像中的靶向造影剂

实体瘤的生长、侵袭和转移依赖于血管生成，对肿瘤血管的成像是早期发现癌症的重要途径。肿瘤血管的形成可发生于肿瘤生长的晚期，为此，研究者们建立了血管生成开关模型学说[6]。一般情况下，血管生成受激活因子和抑制因子影响，当激活因子和抑制因子保持相对平衡时血管生成处于相对平静状态，而在肿瘤发生过程中某个时间点，激活因子上调打破该平衡，从而启动“血管生成开关”,促进血管生成。因此，“血管生成开关”启动是恶性肿瘤发病早期的关键性标志。由于血管生成刺激因子的上涨，内皮表型发生了变化并过度表达大量与血管生成相关的分子，如VEGFR-2和αvβ3，这些分子水平的变化使肿瘤血管不同于正常、成熟血管的形态与生物学特性，这种差异又称为肿瘤血管的异质性。这些与血管生成相关的分子可成为药物及造影剂的靶点[6]。目前，主要的肿瘤血管靶向造影剂有B7-H3靶向造影剂、VEGFR-2靶向造影剂、整合素αvβ3靶向造影剂及发展起来的双靶、多靶造影剂。

2.1 VEGF及其受体靶向造影剂 血管内皮生长因子(VEGF)是一种强大的促进血管内皮细胞增殖的因子，只有当其与血管内皮生长因子受体(VEGFR)结合后才有强大的促血管生成作用。研究表明，VEGF/VEGFR-2是血管生成的主要信号转换器，可通过调节血管内皮细胞增殖、迁移来促进肿瘤内部新生血管的生成，而新生血管可为肿瘤的生长提供营养物质输送和代谢废物排泄通道[7]。因此，VEGF/VEGFR-2对于肿瘤血管生成及肿瘤生长至关重要，这为以VEGF/VEGFR 信号通路为靶点的肿瘤靶向分子成像提供了条件。Pysz等[8]通过制备以VEGFR-2为靶点的超声靶向造影剂,构建小鼠卵巢癌模型,研究靶向造影剂对胰腺癌血管显影效果，他们的研究结果证实了以VEGFR-2为靶点的超声靶向分子成像能作为早期诊断恶性肿瘤的一个新方法。Ehling等[9]运用3D SPAQ 技术和VEGFR-2靶向造影剂(BR55)检测了早期微小乳腺癌中VEGFR-2表达水平，结果表明VEGFR-2靶向超声分子成像可有效诊断出微小乳腺病变甚至微转移患者。值得注意的是，BR55在经过广泛动物模型实验与不同物种毒性实验之后成为第一个亦是目前惟一一种进入美国及欧洲临床初期实验的靶向造影剂，目前研究人员正对BR55的人体内毒性、人体内前列腺癌显影的可行性、人体内可疑性卵巢癌和乳腺癌显影的可行性和有效性进行研究。此外，研究者还通过携带VEGF或VEGFR表达抑制剂的靶向微泡来抑制肿瘤血管生成，以达到有效治疗肿瘤的目的[10]。可见，以VEGF/VEGFR为靶点的靶向超声分子成像对于诊断和治疗肿瘤具有广阔前景。

2.2 B7-H3靶向造影剂 B7-H3又称CD276，是共刺激分子B7家族的一个新成员，共刺激分子在介导T细胞免疫反应中扮演重要角色。对人乳腺肿瘤、膀胱肿瘤、食管肿瘤等肿瘤组织进行研究发现，B7-H3在肿瘤新生血管内皮表面特异性高水平表达，而在对应正常组织的血管内皮上少量表达甚至不表达[11]。因此，B7-H3在肿瘤新生血管内皮和正常组织血管内皮上的这种表达水平差异性使B7-H3成为一个肿瘤血管靶向分子成像的靶点。Bachawal等[12]用新型的B7-H3靶向微泡在小鼠体内对乳腺肿瘤血管进行分子显像，研究表明以B7-H3为靶点的超声分子造影剂结合超声作用能以较高的诊断性区分乳腺癌与乳腺良性实性病变。Lutz等[13]在这方面亦做了相关研究，他们在成功复制小鼠卵巢癌模型的基础上注入靶向造影剂，发现携B7-H3单抗的靶向造影剂可有效聚集至小鼠卵巢癌中,对卵巢癌肿瘤血管进行显影，并且观察到靶向造影剂较非靶向造影剂更多地聚集于肿瘤血管内。另一方面，有不少研究表明,B7-H3的特异性高表达使B7-H3成为抗肿瘤血管新生的一个有效治疗靶点。

2.3 整合素αvβ3靶向造影剂 整合素αvβ3是由α亚基和β亚基经非共价键连接而成。与B7-H3和VEGFR-2类似，αvβ3特异性高表达于多种肿瘤细胞表面和新生血管内皮细胞表面，而在多数正常组织和成熟血管内皮细胞中低水平表达甚至不表达[14]。αvβ3通过与相应配体结合黏附至细胞外基质中的多种成分并相互作用，其配体中均含有RGD(Arg-Gly-Asp)序列。RGD肽可通过生物提取或人工合成获得，且可进行修饰与改造。因此，RGD多肽可作为整合素αvβ3用于肿瘤超声分子显像甚至治疗方面的一个切入点。Anderson等[15]将含有半胱氨酸末端的环状RGD五肽连接至承载吡啶基-丙酸酯的微泡表面成功制成αvβ3靶向微泡，用作肿瘤血管生成的非侵入性超声分子成像探测器。此外，有研究者在成功制备出αvβ3靶向造影剂的基础上,将αvβ3靶向造影剂用于肿瘤血管评价和抗肿瘤药物的输送，研究证实超声靶向微泡不仅能对肿瘤新生血管显影,且可联合超声成像系统发展成为一种的全新药物输送系统,这对肿瘤靶向治疗有远期影响[16]。

2.4 双靶及多靶造影剂 随着对疾病检测敏感性要求越来越高，双靶和多靶造影剂已被开发出来并用于对肿瘤血管的评价。Willmann等[17]成功制备同时携带抗VEGFR-2单抗和抗αvβ3单抗的双靶向微泡，并成功用于评价卵巢癌模型。Warram 等[18]比较了αvβ3、P-选择素和VEGFR-2三重靶向微泡与双靶、单靶微泡对小鼠体内乳腺癌肿瘤血管的可视化程度，结果表明三重靶向微泡的显影效果较双靶、单靶均显著增强。

3 靶向超声分子成像对肿瘤血管的定量评估

迄今，诸多学者的研究表明微血管密度与肿瘤生长、转移和预后密切相关，亦是评价肿瘤血管生成的可靠指标[19]。但目前检测肿瘤组织中的微血管密度方法是采用术后获取病理标本进行免疫组化，无法动态观察。分子声学显影可提供一种术前、无创的定量技术,从而动态地检测肿瘤组织微血管密度。

综上所述，虽然超声分子成像技术用于肿瘤新生血管评价还有部分需要解决的问题，如：①靶向造影剂的构建;②血管外靶组织显像;③双靶及多靶造影剂制备方法、显像效果、安全性均有待进一步研究；④超声靶向造影对肿瘤血管的定量评估。但其有良好的应用前景，对分子成像的进一步研究将推动这一集诊断与治疗的新技术逐渐向临床转化，并扩大超声分子成像技术的应用范围。

[1] Luke GP, Hannah AS, Emelianov SY. Super-resolution ultrasound imaging in vivo with transient laser-activated nanodroplets[J]. Nano Lett, 2016,16(4):2556-2559.

[2] Denbeigh JM, Nixon BA, Lee JJY, et al. Contrast-enhanced molecular ultrasound differentiates endoglin genotypes in mouse embryos[J]. Angiogenesis, 2015,18(1):69-81.

[3] 张炜阳，黄晓玲．用于超声分子成像的聚乳酸-乙醇酸造影剂的研究进展[J]．临床超声医学杂志，2015，17(1)：40-42．

[4] Wang H, Kaneko OF, Tian L, et al. Three-dimensional ultrasound molecular imaging of angiogenesis in colon cancer using a clinical matrix array ultrasound transducer[J]. Invest Radiol, 2015,50(5):322-329.

[5] Oeffinger BE, Wheatley MA. Development and characterization of a nano-scale contrast agent[J]. Ultrasonics, 2004,42(1/9):343-347.

[6] Goel S, Duda DG, Xu L, et al. Normalization of the vasculature for treatment of cancer and other diseases[J]. Physiol Rev, 2011,91(3):1071-1121.

[7] 王伟,殷小涛,田仁礼,等.以VEGF及VEGFR2为靶位的抗肿瘤血管生成主动免疫治疗的研究进展[J].现代生物医学进展,2013，13(8):1567-1571.

[8] Pysz MA, Machtaler SB, Seeley ES, et al. Vascular endothelial growth factor receptor type 2-targeted contrast-enhanced US of pancreatic cancer neovasculature in a genetically engineered mouse model: potential for earlier detection[J]. Radiology, 2015,274(3):790-799.

[9] Ehling J, Misiewicz M, von Stillfried S, et al. In situ validation of VEGFR-2 and αvβ3 integrin as targets for breast lesion characterization[J]. Angiogenesis, 2016,19(2):245-254.

[10] 张劲宜．靶向超声微泡在卵巢癌诊断治疗中的研究进展[J]．国际妇产科学杂志，2013，40(6)：551-554．

[11] 蔡惠芬,史进方,顾国浩,等.宫颈癌组织中 B7-H3 蛋白的表达变化及其与 HPV 感染的关系[J].山东医药,2011,51(30):4-5.

[12] Bachawal SV, Jensen KC, Wilson KE, et al. Breast cancer detection by B7-H3-Targeted ultrasound molecular imaging[J]. Cancer Res, 2015,75(12):2501-2509.

[13] Lutz AM, Bachawal SV, Drescher CW, et al. Ultrasound molecular imaging in a human CD276 expression-modulated murine ovarian cancer model[J]. Clin Cancer Res, 2014,20(5):1313-1322.

[14] Li ZJ, Wu WK, Ng SS, et al. A novel peptide specifically targeting the vasculature of orthotopic colorectal cancer for imaging detection and drug delivery[J]. J Control Release, 2010,148(3):292-302.

[15] Anderson CR, Hu X, Zhang H, et al. Ultrasound molecular imaging of tumor angiogenesis with an integrin targeted microbubble contrast agent[J]. Invest Radiol, 2011,46(4):215-224.

[16] Yan F, Xu X, Chen Y, et al. A Lipopeptide-Based αvβ3 Integrin-Targeted ultrasound contrast agent for molecular imaging of tumor angiogenesis[J]. Ultrasound Med Biol, 2015,41(10):2765-2773.

[17] Willmann JK, Lutz AM, Paulmurugan R, et al. Dual-targeted contrast agent for US assessment of tumor angiogenesis in vivo[J]. Radiology, 2008,248(3):936-944.

[18] Warram JM, Sorace AG, Saini R, et al. A triple-targeted ultrasound contrast agent provides improved localization to tumor vasculature[J]. J Ultrasound Med, 2011,30(7):921-931.

[19] Marech I, Ammendola M, Sacco R, et al. Serum tryptase, mast cells positive to tryptase and microvascular density evaluation in early breast cancer patients: possible translational significance[J]. BMC Cancer, 2014,14(1):534-540.

周军(E-mail:zjsts8@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.09.038

R730.4

A

1002-266X(2017)09-0110-03

2016-04-20)