钟鸣，刘英霞，翁剑华，赵文丽

(惠州市第一人民医院，广东惠州516003)

乳腺浸润性导管癌组织中Pin1、CyclinD1蛋白表达变化及意义

钟鸣，刘英霞，翁剑华，赵文丽

(惠州市第一人民医院，广东惠州516003)

目的 观察Pin1和CyclinD1蛋白在乳腺浸润性导管癌组织中的表达并探讨其临床意义。方法 采用免疫组化法检测108例乳腺浸润性导管癌和30例正常乳腺组织石蜡切片中Pin1和CyclinD1蛋白表达，分析二者表达与乳腺癌患者临床病理特征的关系。结果 Pinl蛋白在正常乳腺组织中不表达，在乳腺癌组织中阳性表达定位于细胞核，微弱表达时胞核少许轻微着色，过表达时胞核和胞质均着色。Pinl蛋白在55.6%(60/108)乳腺浸润性导管癌患者癌组织中呈阳性或强阳性表达。Pin1蛋白表达与患者组织学分级、淋巴结转移有关(P均<0.05),而与年龄、肿瘤大小、临床分期无关(P均>0.05)。CyclinD1蛋白在正常乳腺组织中不表达。CyclinD1蛋白在乳腺癌组织中阳性表达定位于细胞核，65例表达阳性，阳性表达率为60.2%。CyclinD1蛋白表达与淋巴结转移有关(P<0.05),而与年龄、肿瘤大小、组织学分级、临床分期无关(P均>0.05)。在浸润性导管癌组织中Pin1与CyclinD1蛋白表达呈正相关(r=0.224,P<0.05)。结论 Pin1和CyclinD1蛋白在浸润性乳腺癌组织中呈高表达；二者可能在乳腺浸润性导管癌侵袭和转移中发挥作用。

乳腺浸润性导管癌；Pin1蛋白；CyclinD1蛋白；免疫组织化学

肽基脯氨酰顺反异构酶Pin1是一种高度保守的、特异性多肽脯氨酰基顺反异构酶，能特异性地识别和结合磷酸化蛋白质的丝/苏氨酸-脯氨酸基序，并催化其发生顺反异构，然后调控诸多细胞周期蛋白的构象，从而调节细胞的增殖与分化。最近国外大量研究发现，Pin1过表达与肿瘤发生发展有关，其可直接或间接与CyclinD1相互作用而调节细胞周期。虽然在各种肿瘤发病机制中的作用尚存在争议，但进一步研究Pin1作用将为各种肿瘤的病因、预防和治疗提供新的思路和方法。2016年12月，我们采用免疫组化法对乳腺浸润性导管癌组织中Pin1及CyclinD1蛋白表达进行检测，同时分析二者表达与乳腺浸润性导管癌患者临床病理特征的关系。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集我院2011年4月～2013年3月的108例乳腺浸润性导管癌患者手术切除标本或粗针穿刺活检标本制成的蜡块，患者年龄28～66岁。送病理前均未进行任何治疗。乳腺癌病理学分型及组织学分级参照2010年乳腺癌WHO 分类和分级标准。肿瘤直径≥3 cm者70例；组织学分级Ⅰ+Ⅱ级52例，Ⅲ级56例；临床分期Ⅰ+Ⅱ期38例，Ⅲ+Ⅳ期70例；淋巴结转移57例。选取同期30例份正常乳腺组织作对照，年龄38～64岁。

1.2 Pin1及CyclinD1蛋白表达检测 采用免疫组化Envision法。一抗分别为浓缩型兔抗人Pinl多克隆抗体(美国Santa Cruz公司，SC-15340，工作浓度1∶300)；浓缩型兔抗人CyclinD1单克隆抗体(ZA-0101，工作浓度1∶50)；二抗和显色检测系统均为DAKO Envision检测试剂套盒。试剂均购自上海基因科技有限公司。用已知的Pin1、CyclinD1阳性切片作为阳性对照，用PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照。标本均经10%中性甲醛固定8～12 h，常规石蜡包埋，3 μm厚连续切片，常规二甲苯脱蜡和梯度乙醇至水后，pH值9.0 Tris-EDTA微波修复20 min，3%过氧化氢水溶液阻断10 min，浸洗PBS 5 min×3次，一抗室温孵育1 h，浸洗PBS 5 min×3次，二抗室温孵育30 min，浸洗PBS 5 min×3次，在显微镜下控制DAB显色3～5 min，苏木素复染2 min，1%盐酸乙醇分化数秒，饱和碳酸锂水溶液返蓝数秒，梯度乙醇脱水透明，中性树胶封片。在盲法下，每张切片选择5个高倍视野，每高倍视野计数100个瘤细胞，由2名病理医师独立计数，取平均值进行分析。Pin1阳性染色位于胞核，过表达时胞核胞质均着色。CyclinD1蛋白定位于胞核。Pin1和CyclinD1免疫组化检测结果判断标准[1]：A染色强度分级：无染色者计0分，可见淡黄色颗粒计1分，较多棕黄色颗粒计2分，大量棕黄色颗粒计3分；B阳性细胞数分级：阳性细胞率<1%计0分，阳性细胞率1%～33%计1分，阳性细胞率34%～66%计2分，阳性细胞率≥67%计3分；随后根据两项的积分对结果进行判定：积分数=A×B。当A×B<3分时判为低水平表达，计为阴性(-)；当A×B≥3分时判为高水平或过表达，计为阳性(+)。

1.3 统计学方法 采用SPSS21.0统计软件。计量资料比较采用t检验，计数资料比较采用χ2检验，Pin1和CyclinD1蛋白的相关性分析采用Spearman法。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 乳腺浸润性导管癌组织中Pin1、CyclinD1蛋白表达及其与患者临床病理特征的关系 Pin1蛋白在正常乳腺组织中不表达，在乳腺癌组织中阳性表达定位于细胞核，微弱表达时胞核少许轻微着色，过表达时胞核和胞质均着色。Pin1蛋白在55.6%(60/108)乳腺浸润性导管癌患者癌组织中呈阳性或强阳性表达。Pin1蛋白表达与患者组织学分级、淋巴结转移有关(P均<0.05),组织学分级级Ⅰ+Ⅱ级阳性表达率为55.8%，Ⅲ级为55.4%；淋巴结转移者阳性表达率为68.4%，无淋巴结转移者阳性表达率41.2%。Pin1蛋白表达与年龄、肿瘤大小、临床分期无关(P均>0.05)。CyclinD1蛋白在正常乳腺组织中不表达。CyclinD1蛋白在乳腺癌组织中阳性表达定位于细胞核，65例表达阳性，阳性表达率为60.2%。CyclinD1蛋白表达与淋巴结转移有关(P<0.05),淋巴结转移者阳性表达率为74.1%，无淋巴结转移者阳性表达率44.0%。CyclinD1蛋白表达与年龄、肿瘤大小、组织学分级、临床分期无关(P均>0.05)。

2.2 Pin1和Cyclin D1蛋白表达的相关性分析 在Pin1表达阳性的60例乳腺癌中有42例CyclinD1表达表达阳性，在Pin1表达阴性的48例乳腺癌中有25例CyclinD1表达阴性，二者在乳腺癌中的表达呈正相关(r=0.224,P<0.05)。

3 讨论

肽基脯氨酰异构酶Pin1使磷酸化丝/苏氨酸-脯氨酰键发生异构化，这种异构化在调节细胞动态平衡中发挥关键作用。Pin1通过其氨基末端的WW结构域与磷酸化丝/苏氨酸-脯氨酸结合及其羧基末端PPIase域催化中间的肽键发生顺反异构化，最终导致其底物的构象发生变化[2]。Pin1诱导构象变化磷酸化后调控诸多蛋白质的功能，包括催化活性水平，磷酸化状态，蛋白质相互作用，亚细胞定位，蛋白质的稳定性[3]。Tao等[4]报道，Pin1本身不是致癌基因，但其可能是致癌信号传导过程中一个不可缺少的翻译器和放大器。Pin1特异性识别磷酸化丝/苏氨酸-脯氨酸的基序和调节磷酸化位点的构象，这可能激活肿瘤发生过程中多条致癌信号通路。因此，Pin1的功能多态性在生物学上可能是癌症的重要病因学[5]。本研究结果提示，Pin1在正常乳腺组织中不表达或呈微弱表达，而在乳腺癌组织中呈高表达。Pin1低表达时主要定位于细胞核，高表达时胞浆胞核均会着色，此与文献报道相似[6]。因Pin1本身不含有胞核定位信号，主要通过WW区域和底物相互作用定位于细胞内，因细胞状态不同而异。同时，Pin1过表达与组织学分级、淋巴结转移相关,而与年龄、肿瘤大小、临床分期无明显相关性。这可能是因Pin1靶底物近30种，参与调解细胞多个进程。据文献报道，Pin1放大诸多致癌信号传导途径，抑制多种肿瘤抑制基因，促进乳腺癌细胞的血管生成和转移[7]。本研究结果提示Pin1过表达可能促进乳腺癌生长，但由于样本量有限，结论可能存在一定偏差，有待进一步扩大样本予以证实。

Pin1是由酵母双杂交筛选出的一种功能蛋白，主要调节有丝分裂相关蛋白酶，对细胞周期发挥重要的调节作用。周期素中的CyclinD1是细胞周期成分中与肿瘤有直接关系的癌基因[8]。Pin1的靶蛋白有20多种，其中研究最多的就是CyclinD1，CyclinD1作为G1期细胞周期相关蛋白其基因和编码蛋白的异常在肿瘤发生发展中扮演重要角色。研究表明，CyclinD1是Pin1作用的重要靶蛋白之一，Pin1不仅可从转录水平促进CyclinD1转录，而且还能通过诱导CyclinD1从胞核移至胞浆降解，进而引起CyclinD1过表达，促进乳腺上皮细胞转化增殖。本研究结果显示，Pin1在正常乳腺组织中不表达，仅在乳腺癌组织中着色。在Pin1过表达的60例乳腺癌中42例合并有CyclinD1高表达，而在Pin1低表达的48例乳腺癌中仅有25例CyclinD1阴性表达，与此同时CyclinD1表达还与淋巴结转移有关。Wang等[9]报道在肿瘤发生癌变过程中，Ras信号和CyclinD1过表达起关键作用，Pin1过表达后上调CyclinD1蛋白表达并激活其启动子。此外，Pin1通过激活JNK或致癌的Ras与c-Jun结合，使丝氨酸63/73-脯氨酸磷酸化。总之，Pin1无论是激活Ras还是JNK，均是为提高CyclinD1启动子c-Jun的转录活性。Pin1在前列腺癌[10]、鼻咽癌[11]、宫颈癌[12]等亦上调CyclinD1表达。Pin1可能直接或间接与CyclinD1相互作用而调节细胞周期，参与肿瘤的发生发展。基于Pin1在正常乳腺组织和在乳腺癌组织中的表达水平差异，故有可能通过检测 Pin1过表达来实现肿瘤的早期诊断。Pin1在多种肿瘤中高表达说明其可用作肿瘤标记的参考指标，其表达与肿瘤的临床病理因素、肿瘤预后等的关系有待后续深入研究。

综上所述，Pin1和CyclinD1蛋白在浸润性乳腺癌组织中呈高表达；二者可能在乳腺浸润性导管癌侵袭和转移中发挥协同作用。

[1] Miyashita H, Mori S, Motegi K， et al. Pinl is overexpressed inoral squamous cell carcinoma and its levels correlate with cyclin D1 overexpression[J]． Ocol Rep， 2003，10(2)：455-461．

[2] Bae JS, Noh SJ, Kim KM, et al. PIN1 in hepatocellular carcinoma is associated with TP53 gene status[J]. Oncology Reports, 2016,36(4):2405-2411.

[3] Kim G, Khanal P, Kim JY, et al. COT phosphorylates prolyl-isomerase Pin1 to promote tumorigenesis in breast cancer[J]. Molecular Carcinogenesis, 2015,54(6):440-448.

[4] Tao LJ, Chen YS, Yao L, et al. PIN1 promoter polymorphism (-842 G>C) contributes to a decreased risk of cancer: Evidence from meta-analysis[J]. Oncol Lett, 2014,8(3):1360-1366.

[5] Xu M, Cheung CC, Chow C, et al. Overexpression of PIN1 enhances cancer growth and aggressiveness with cyclin D1 induction in EBV-associated nasopharyngeal carcinoma[J]. PLoS One, 2016,11(6)：e0156833.

[6] You Y, Deng J, Zheng J, et al. Functional polymorphisms in PIN1 promoter and esophageal carcinoma susceptibility in Chinese population[J]. Mol Biol Rep, 2013,40:829-838.

[7] Beretta GL, De Cesare M, Albano L, et al. Targeting peptidyl-prolyl isomerase pin1 to inhibit tumor cell aggressiveness[J]. Tumori, 2016,102(2):144-149.

[8] 张萍，高媛.CyclinD1在肿瘤中的表达及意义[J].山东医药，2005,45(34):69-70.

[9] Wang JZ, Liu BG. Pin1-based diagnostic and therapeutic strategies for breast cancer[J]. Pharmacol Res, 2015,9(3):28-35.

[10] Kanaoka R, Kushiyama A, Seno Y, et al. Pin1 inhibitor juglone exerts anti-oncogenic effects on LNCaP and DU145 cells despite the patterns of gene regulation by Pin1 differing between these cell lines[J]. PLoS One, 2015,10(6)：e0127467.

[11] Xu M, Cheung CC, Chow C, et al. Overexpression of PIN1 Enhances Cancer Growth and Aggressiveness with Cyclin D1 Induction in EBV-Associated Nasopharyngeal Carcinoma[J]. PLoS One, 2016,11(6):e0156833.

[12] Wang T, Liu Z, Shi F, et al. Pin1 modulates chemo-resistance by up-regulating FoxM1 and the involvements of Wnt/beta-catenin signaling pathway in cervical cancer[J]. Mol Cell Biochem, 2016,413(1-2):179-187.

惠州市科技局研究项目(0039107150321045)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.09.018

R737.9

B

1002-266X(2017)09-0055-03

2016-11-15)