王蕾，张庆玲

(1南方医科大学南方医院，广州510515;2南方医科大学基础医学院·广东省分子肿瘤病理学重点实验室)

小鼠结直肠癌CT26细胞WTX基因稳定干扰系的建立

王蕾1,2，张庆玲1,2

(1南方医科大学南方医院，广州510515;2南方医科大学基础医学院·广东省分子肿瘤病理学重点实验室)

目的 应用WTX基因重组慢病毒干扰载体，感染小鼠结直肠癌CT26细胞，建立WTX稳定干扰小鼠结直肠癌CT26细胞系。方法 慢病毒感染小鼠结直肠癌CT26细胞，荧光显微镜初步观察感染效率，G418进一步筛选得到稳定感染细胞系。qPCR及Western blotting、免疫组织化学检测WTX mRNA及蛋白干扰效率。结果 慢病毒感染小鼠结直肠癌CT26细胞后，WTX基因mRNA及蛋白表达水平明显下调，差异有统计学意义，CT26结直肠癌细胞WTX干扰稳定细胞系构建成功。结论 用慢病毒感染方法成功建立了小鼠结直肠癌CT26细胞WTX稳定干扰细胞系。

结直肠癌；WTX基因；慢病毒载体； 稳定转染

WTX基因(又称作FAM123B、AMER1、OSCS)，是Rivera等在肾母细胞瘤(Wilms瘤)的研究中发现的首个位于X染色体上的抑癌基因WTX基因[1]。不同于常染色体显性遗传的肿瘤抑制基因，WTX经由单次打击目标男性X染色体或活跃的女性X染色体而发生突变或失活[2]。WTX基因最初从肾Wilms瘤患者中发现，目前对WTX的研究主要集中于Wilms瘤方面[3]。研究发现Wilms瘤中WTX的突变是其主要失活机制，Wilms瘤中WTX基因以Wnt/β-catenin信号通路为作用靶点。WTX通过与APC结合，诱导β-catenin蛋白的降解而抑制Wnt信号通路的传导[4]。已知Wnt/β-catenin信号通路是一个由多种分子参与、相互影响、相互制约和协同作用的复杂体系，对细胞增殖和分化及肿瘤发生发展等多种生理病理有重要调节作用[5]。WTX突变导致其丧失对Wnt/β-catenin信号通路的负性调控作用，而促进Wilms瘤的进展[6,7]。基于抑癌基因WTX的研究现状，全面了解WTX基因功能可能为恶性肿瘤(尤其是结直肠癌)发生发展机制的研究提供新的依据。我们前期研究发现WTX表达缺失，可能在结直肠癌发生发展中发挥作用。2015年2月，我们通过构建WTX稳定干扰慢病毒载体，在小鼠结直肠癌细胞中建立稳定干扰慢病毒的细胞系，为体内体外研究抑癌基因WTX在结直肠癌的发生发展中的作用机制提供分子生物学工具。

1 材料与方法

1.1 材料 小鼠结直肠癌CT26细胞系为南方医科大学病理学系自存；WTX慢病毒上清购自上海吉凯基因技术有限公司；Lipofectamine2000购自Invitrogen公司，RMPI1640培养基购自Hyclone公司，胎牛血清购自澳洲BI；RNA提取试剂RNAisoTM Plus购自日本TaKaRa公司，WTX多克隆抗体购自AbGene，β-actin单克隆的抗体购自广州市中杉金桥公司；WTX和GAPDH引物来自Invitrogen公司；ECL化学发光液购自南京凯基生物技术公司。

1.2 细胞培养 将人结直肠癌SW620、HT29、SW480、HCT116细胞系用含10%胎牛血清的RMPI 1640培养基，于常温37 ℃、含5%CO2、饱和湿度的培养箱内进行培养，选取处于生长对数期、状态良好的细胞进行实验，当细胞生长密度至80%～90%饱和时，用2.5%含EDTA的胰酶消化传代。

1.3 慢病毒颗粒感染小鼠结直肠癌CT26细胞 将生长状态良好的CT26细胞铺24孔板，细胞密度30%～50%，细胞分为目的组与阴性对照组，用含10%胎牛血清的 RPMI1640 培养基培养过夜，待细胞贴壁后，即可用于转染。转染前1 h将培养基更换为无血清培养基，实验组每孔加入 5～10 μL 滴度为2×108的WTX慢病毒上清，混合加入 1～2 μL polybrene；阴性对照组每孔加入 1～2 μL 滴度为8×108的Negative Control 慢病毒上清, 加入同目的组等体积polybrene。孵育8～12 h，使用含 10%胎牛血清的RPMI1640全培养基换液，继续孵育 48～72 h。感染72～96 h后，荧光显微镜下初步观察并判断感染效率，准备G418药物筛选。

1.4 G418筛选浓度测定及WTX感染稳定细胞系的建立 以未经感染的小鼠结直肠癌细胞CT26对G418最佳用药浓度进行筛选，将结直肠癌细胞接种于24孔板， 待次日细胞密度达50%～70%时， 更换培养基并加入浓度分别为500、 800、 1 000、 2 000、 3 000 ng/mL的G418开始筛选，以10～14 d内细胞全部死亡的最低浓度定为最佳筛选浓度。筛选结果确定G418最佳用药浓度为800 ng/mL。将慢病毒感染后的结直肠癌细胞，按 50%～70%密度接种于6孔板，铺板24 h后，按比例加入浓度为800 ng/mL的G418，细胞生长达90%时可用含G418的培养基传代继续培养，维持药物浓度持续培养10～14 d，并在对照组细胞全部死亡时终止筛选。得到慢病毒稳定感染的细胞系。

1.5 WTX基因mRNA表达检测 采用荧光定量PCR法。将分选后的目的及对照组细胞，48 h后分别提取RNA ，qPCR 检测WTX的表达。将处于对数生长期、生长密度达80%～90%状态良好的细胞，用预冷的PBS清洗2遍，按1 mL/10 cm2瓶壁面积加入适量TRIzol试剂，反复吹打裂解5 min，裂解液移至去RNAase/DNAase free的1.5 mL EP管；于EP管中，按0.2 mL氯仿/1 mL TRIzol比例加入氯仿，振荡混匀，冰上放置10 min，4 ℃，12 000 g离心15 min后，裂解液分为明显三层，将上层水相转移至新的RNAase/DNAase free离心管中，加入与水相等体积异丙醇混匀，室温静置10 min后，4 ℃、12 000 r/min离心20 min，将管底白色沉淀用75%乙醇洗涤一次，12 000 r/min离心5 min，室温放置至自然干燥，最后用适量DEPC水溶解沉淀，紫外分光光度仪检测RNA浓度。冰上融解基因反转录所需的试剂，短暂离心混匀之后放置于冰上待用。按照TaKaRa (PrimerScriptTMRT Reagent Kit)逆转录试剂说明书，配置反应体系，PCR仪设置反应条件：37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s，-20 ℃保存备用。荧光定量PCR检测目的细胞以及对照细胞中WTX相对表达量，GAPDH做内参。引物的设计使用Primer 5.0软件，引物序列如下：WTX F：5′-GACCCAAAAGGATGAAGCT-3′，R：5′-CCCCTCCAAAGAAACTAGGC-3′；GAPDH F：5′-ACAGCCCGCAGGATCAGGAAA-3′，R：5′-AACACGCTTCACGGGCACTC-3′。

1.6 细胞系中WTX基因蛋白表达检测 采用Western blotting法。收集细胞，用预冷的PBS清洗2～3次，将洗液弃去，加入适量RIPA细胞裂解液(裂解液的配制∶裂解液∶PMSF混合液∶蛋白酶抑制剂∶磷酸酶抑制剂=1 mL∶10 μL∶1 μL∶5 μL)，超声波裂解3～5 s后，冰上静置10 s，如此重复超声3～5次；冰上静置裂解30 min，4 ℃ 12 000 r/min离心30 min，将上清转移至新1.5 mL EP管中，-80 ℃保存备用。蛋白浓度测定根据Pierce公司BCA Protein Assay Reagent Kit说明书进行。将BCA法检测样品的蛋白浓度。配制8%的SDS-PAGE凝胶，将蛋白100 ℃变性5 min后，以40 μg的蛋白质量上样，100 V恒压电泳，直至通道内溴酚蓝跑到凝胶底部预定位置，电泳分离后切取目的条带，湿法转膜2 h电转至0.45 μm PVDF膜，转膜时间结束后，取出PVDF膜甲醇固定3 min后，5%的脱脂奶粉室温封闭1 h，一定稀释比例的一抗(WTX 1∶200)4 ℃孵育过夜， PBST清洗3 min×5次，辣根酶标记的山羊抗兔二抗(山羊抗兔IgG抗体， 1∶5 000)室温孵育 1 h，PBST 清洗 3 min×5 ，将ECL工作液均匀覆盖PVDF膜上，置入荧光成像仪内曝光观察。GAPDH做内参。

1.7 细胞系构建的裸鼠皮下瘤组织中WTX基因蛋白表达检测 采用免疫组织化学法。取稳定转染状态良好的细胞用于皮下成瘤实验，待细胞生长密度达到80%～90%时，胰酶常规消化后反复吹打制成单细胞悬液，PBS洗涤细胞3次，细胞计数；以1107 个细胞终体积100 μL打入3～5周龄雌性BALB/C鼠的右下侧背部；密切观察小鼠，待7 d后皮下瘤子长出后，每隔2 d用游标卡尺测量一次肿瘤体积并记录数据；30 d后处死小鼠，分离皮下肿瘤组织，将肿瘤组织放入10%中性甲醛中固定24～72 h，进行组织脱水、包埋。HE染色检测原位瘤体积大小，观察原位瘤组织细胞的一般形态结构特点，免疫组化法检测WTX基因蛋白表达。

1.8 统计学方法 采用SPSS20.0软件。采用独立样本t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 慢病毒颗粒感染及G418药物筛选 将CT26细胞以30%～50%的密度铺入24孔板，贴壁后每孔细胞加入15～25 μL慢病毒液，感染48 h后荧光显微镜下观察细胞生长状态良好，可见到绿色荧光，感染效率为40%～50%。根据已经筛选好的药物浓度，加入浓度为800 ng/mL G418，药物筛选28 d后在荧光显微镜下观察带绿色荧光细胞单克隆形成，挑单克隆扩大培养，获得慢病毒稳定干扰WTX的细胞系CT26.shW。

2.2 稳定感染细胞株mRNA及蛋白水平定量分析鉴定 CT26.shW及对照细胞CT26.SCR中WTX mRNA的表达效率分别为0.406 1、1.001 9，WTX mRNA在CT26.shW 组中的表达明显低于CT26.SCR组，差异有统计学意义。Western blotting检测WTX蛋白在CT26.shW 细胞系中的表达效率，结果提示：在GAPDH做loading control 的基础上，WTX蛋白在CT26.shW 细胞中的表达明显降低。CT26.shW及对照细胞CT26.SCR中WTX 蛋白的表达效率分别为4.761 9、259 998.999 9，二者结果综合提示结直肠癌WTX稳定沉默表达细胞系构建成功。

2.3 HE对稳定感染细胞系构建的皮下瘤组织细胞形态观察及皮下瘤组织中蛋白水平 将处理组细胞所形成的部分皮下瘤，经常规HE染色观察皮下瘤组织结构，与对照组相比，CT26.shW皮下瘤组织中，细胞分化差，形态呈多态性，核分裂多，异型性明显。经常规免疫组织化学实验检测，结果与对照结直肠皮下瘤组织相比，WTX在CT26.shW皮下瘤组织中低表达。体内水平证明WTX干扰细胞系建立成功。

3 讨论

结直肠癌是当今全球最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和病死率分别位于恶性肿瘤中第三位和第四位[8]。每年新确诊的病例数已增至120万，并有超过50%的病患最终死于结直肠癌及其并发症[9]。结直肠癌在各地区的发病率有明显差异，由于生活习惯等原因，西方国家的发病率普遍高于亚、非地区[10]。然而近年来，随着国内生活水平提高，饮食方式的改变，我国结直肠癌的发病率呈现明显上升趋势[11]。

结直肠癌的发生发展是一个由多种基因参与、多个因素影响、经历多个阶段的极为复杂的生物学过程。众所周知癌基因及抑癌基因均参与了肿瘤的发生发展，包括癌基因的激活、抑癌基因的缺失或突变失活，MMR的突变及失活，其中抑癌基因的失活发挥重要作用[12]。在肿瘤发生发展的过程中，肿瘤细胞周期调控系统受到胞外信号与各种胞内信号的影响，导致细胞增殖、分化、凋亡及幸存机制出现紊乱，其中有大量的生长因子及其受体参与调控，某些生长因子还可作为胞外信号通过与膜受体结合，触发信号转导级联反应。目前已知的与结直肠癌发生、发展相关的抑癌基因包括， APC[13]、p53[14]、DCC[15]、MMR等，原癌基因有k-ras[16]、c-myc[17]等，已发现参与作用的主要分子通路为 Wnt/β-catenin信号通路。

2007年Rivera等在肾母细胞瘤的研究中发现，位于X染色体上的一个基因发生了体细胞缺失，该基因是研究者发现的首个位于X染色体上的抑癌基因，Rivera等将其命名为WTX(又称作FAM123B、AMER1)。由于WTX基因位于X染色体上，且人类所有的X染色体只带有一个功能等位体，因此对于男性而言，X染色体一个单突变就会使抑癌基因沉默，导致肿瘤的发生。女性拥有两条X染色体，但在正常生长发育过程中，一条X染色体失活，导致位于该条X染色体上的基因沉默，如果WTX基因的突变发生在女性有活性的X染色体上，则可导致女性成为肾母细胞瘤患者。WTX基因的这种“one-hit”特性预示着抑癌基因在肿瘤形成过程中的作用可能有某种新的方式。目前对WTX作用机制的相关研究并不多，主要集中在肿瘤中WTX突变率及缺失率的检测，如合并有颅骨硬化症的条纹状骨病[18,19]、白血病[20]、消化道肿瘤和肾上腺皮质瘤等[21]。本研究用慢病毒感染小鼠结直肠癌细胞CT26，采用G418药物筛选稳定感染克隆，最终得到稳定感染的细胞系。qRT-PCR 与 Western blotting 的结果证实，与对照组细胞CT26.SCR相比，稳定感染后的细胞CT26.shW中WTX基因的 mRNA与蛋白表达均出现明显下调，差异有统计学意义。免疫组化结果证实，由稳定感染后的细胞CT26.shW建立的小鼠皮下瘤组织中，WTX蛋白表达明显下降，综合以上结果表示，结直肠癌内WTX稳定过表达细胞系构建成功，可用于后续的进一步实验。

综上所述，本试验成功建立了小鼠结直肠癌WTX稳定干扰的CT26细胞系， 为后续研究WTX在结直肠癌发生、发展中的作用及机制提供了分子基础工具，对揭示WTX功能机制、结直肠癌进展机理和临床治疗新方法的发现等方面均有重要意义。

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Establishment of a mouse colorectal cancer CT26 cell line with stable interference of WTX gene

WANGLei1,ZHANGQingling

(1NanfangHospital,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China)

Objective Using a WTX gene recombinant lentivirus interference vector to infect the mouse colorectal cancer CT26 cell line to establish a mouse colorectal cancer CT26 cell line with stable interference of WTX gene.Methods The recombinant lentiviral was transformed in mouse colorectal cancer CT26 cells, and fluorescence microscopy was used to observe the preliminary infection efficiency. The stably transfected cells were selected with G418. The cellular expression of WTX mRNA was detected using quantitative PCR and the cellular expression of WTX protein was detected by immunohistochemistry and Western blotting. Results After the mouse colorectal cancer CT26 cells were infected by lentiviral, the expression levels of WTX mRNA and protein were significantly decreased in CT26 cells, indicating a mouse colorectal cancer CT26 cell line with stable interference of WTX gene was successfully established. Conclusion We successfully established a mouse colorectal cancer CT26 cell line with stable interference of WTX by lentiviral infection.

colorectal carcinoma; WTX gene; lentivirus vector; stable transfection

国家自然科学基金资助项目(81272760；81472712)。

王蕾(1990-)，女,主治医师，医学硕士，主要研究方向为肺癌转移。E-mail：550706856@qq.com

张庆玲(1970-)，女,教授，博士生导师,主要研究方向为肿瘤机制并动物模型建立。E-mail：zqllc8@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.09.004

R735.3

A

1002-266X(2017)09-0012-04

2016-12-24)