张望，朱萱

(南昌大学第一附属医院，南昌330006)

NOX介导的氧化应激对肝纤维化相关信号通路调控的研究进展

张望，朱萱

(南昌大学第一附属医院，南昌330006)

肝纤维化是各种慢性肝脏疾病的共同病理结果，以细胞外基质尤其是Ⅰ型和Ⅲ型胶原的过度沉积为主要特点，其持续进展可导致肝硬化，甚至肝癌。NADPH氧化酶(NOX)是一种多亚基组成的跨膜酶复合物，众多研究表明其介导的氧化应激在肝纤维化的发病机制中发挥重要作用，并参与调控多条肝纤维化相关信号通路，如TGF-β/Smad信号通路、MAPK信号通路、PI3K-AKT信号通路、NF-κB信号通路。

NADPH氧化酶；氧化应激；肝纤维化；信号通路

肝纤维化是肝脏对各种慢性损伤刺激发生修复反应的共同病理结果[1]， 其以细胞外基质(ECM)尤其是Ⅰ型和Ⅲ型胶原的过度沉积为主要特点，肌成纤维细胞是肝纤维化发生时ECM的主要来源，肝纤维化的持续进展可演变为肝硬化，甚至肝癌。目前国内外大量研究表明肝星状细胞(HSCs)活化、增殖为肝纤维化发生的中心事件。众多因素(如肝细胞凋亡、细胞因子刺激等)可导致HSCs活化，活化的HSCs形态和功能发生一系列改变，转变为肌成纤维细胞，导致ECM大量分泌，从而引起肝纤维化的发生。越来越多的研究表明氧化应激与HSCs的活化、肝纤维化的发生密切相关，而NADPH氧化酶(NOX)作为目前唯一已知的专职产生活性氧簇(ROS)的酶类，其介导的氧化应激在肝纤维化发病中起重要作用，抑制NOX介导的氧化应激能明显减少HSCs活化，抑制肝纤维化发生。现就NOX介导的氧化应激对肝纤维化相关信号通路调控的研究进展作一综述。

1 NOX介导的氧化应激概述

氧化应激是指机体反应活性氧簇(ROS)的产生与抗氧化防御系统(酶性抗氧化剂和非酶性抗氧化剂)之间的平衡被打破，机体ROS过度产生，内源性抗氧化防御系统功能减退，从而引起机体组织细胞发生损伤[2]。ROS种类繁多，包括超阴离子、过氧化氢、羟自由基和单线态氧等，在生理状态下，ROS作为正常代谢产物具有多种生物学功能，对正常细胞的增殖、分化和凋亡均有重要作用，但在病理状态下，ROS过量产生则会导致氧化应激，其可通过多种机制损伤细胞的结构和功能，如直接氧化细胞组分，导致脂质过氧化或激活细胞内氧化还原信号通路，促进细胞凋亡等，参与多种疾病(自身免疫性疾病、癌症和纤维化等)的发生[3]。在肝脏中，ROS具有多种来源，包括线粒体呼吸链、细胞色素P450单加氧酶、黄嘌呤氧化酶、微粒体、过氧化物酶体和NOX[4]。NOX是由多亚基组成的跨膜酶复合物，是目前惟一已知的专职产生ROS的酶类[5]，其最早发现于吞噬细胞中，后来研究表明NOX在多种组织细胞中均有表达。迄今为止，人类已发现7种NOX成员：NOX1、NOX2、NOX3、NOX4、NOX5、DUOX1和DUOX2，他们共同组成NOX家族。在NOX家族中，吞噬细胞型NOX2是目前研究最为清楚的成员，吞噬细胞型NOX由细胞膜上的催化亚基NOX2(gp91phox)、调节亚基P22phox和胞质调节亚基P47phox、P40phox、P67phox、Rac1、Rac2组成，其中NOX2和P22phox在细胞膜上形成异二聚体-黄素细胞色素b558复合物，当NOX受到各种刺激因素作用时，亚基P47phox被磷酸化，随后胞质调节亚基移位至胞膜同黄素细胞色素b558复合物相互作用，导致NOX活化，活化的NOX以NADPH为电子传递体将电子传递给氧分子，从而产生ROS[3,6]。非吞噬细胞型NOX(NOX1、NOX3、NOX4、NOX5、DUOX1和DUOX2)的结构与吞噬细胞型NOX类似，但在亚基组成和酶活化方面存在一定差异，如NOX1的组装与活化需NOXO1亚基(P47phox的同系物)和NOXA1亚基(P67phox的同系物)参与[7]，而NOX4的活化则仅需胞质调节亚基P22phox的募集[8]。NOX表达于多种组织细胞中，其中肝脏既有吞噬细胞型NOX表达，亦有非吞噬细胞型NOX表达，Paik等[9]研究表明在CCl4和胆管结扎诱导的实验性肝纤维化小鼠模型中，肝脏NOX1和NOX2表达上调，而NOX1和NOX2缺失后，肝纤维化程度、HSCs的活化数量和肝脏脂质过氧化程度则明显减轻，AngⅡ诱导的HSCs ROS产生亦明显减少。Lan等[10]研究发现在肝硬化患者中，肝脏NOX1和NOX4蛋白水平明显增加，但在NOX1和NOX4基因敲除的CCl4诱导肝纤维化的小鼠中，肝脏的炎症、氧化应激和纤维化程度下降，同时，NOX1/NOX4双重抑制剂GKT137831可阻断LPS、PDGF和Hedgehog(Hh)配体Shh诱导的HSCs ROS产生。

2 NOX介导的氧化应激参与调控肝纤维化TGF-β/Smad信号通路

TGF-β超家族是由诸多有共同生物学特征的蛋白信号分子组成，其包括TGF-β亚族、激活素亚族、抑制素亚族、骨形态形成蛋白亚族(BMPs)和生长分化因子(GDFs)等，参与细胞生长分化、肿瘤发生和损伤修复等多种生物学效应[11]。TGF-β亚族由TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3构成，TGF-β因子以无活性的前体形式分泌，经TGF-β激活激酶活化后而发挥作用，活化的TGF-β首先与细胞膜表面的TGF-β受体结合形成受体异聚体复合体，随后受体异聚体复合体活化下游信号转导分子Smad2/3，活化的Smad2/3与Co-smad(Smad4)结合成多聚体移位至胞核，进而调节相关靶基因的转录表达。TGF-β亚族以Smad依赖途径参与多种纤维化疾病的发生，其中TGF-β1与肝纤维化的发生密切相关[12]。Zhang等[13]研究表明在CCl4诱导纤维化大鼠的肝脏中，P-Smad2和P-Smad3表达上调，Smad3过表达能明显增加TGF-β1诱导的HSCs胶原分泌和TIMP-1表达，而Smad2则可抑制TGF-β1/Smad3介导的HSCs胶原沉积而发挥抗纤维化作用。TGF-β通过Smad依赖途径活化HSCs，同时伴随HSCs NOX4亚基表达上调，而敲除NOX4则可抑制TGF-β诱导的HSCs活化，但敲除NOX4并不抑制TGF-β及其受体的表达，亦不改变Smad2/3的磷酸化水平，表明在HSCs中，NOX4为TGF-β/Smad信号通路的下游信号分子[14,15]。同时，在TGF-β诱导肝细胞凋亡过程中，沉默NOX4、应用抗氧化剂或NOX抑制剂DPI可阻断TGF-β诱导的肝细胞ROS产生和Caspase-3活化，抑制肝纤维化进展[14]。

3 NOX介导的氧化应激参与调控肝纤维化MAPK信号通路

MAPK是一类广泛存在于真核细胞中的丝/苏氨酸蛋白激酶，其可被一系列胞外刺激(细胞因子、生长因子和氧化应激等)激活，活化的MAPK移位至胞核从而调节靶基因的转录表达。MAPK家族主要包括4个亚族：细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、p38和大丝裂素活化蛋白激酶1(BMK-1)。MAPK的激活是细胞内磷酸化级联反应的结果，经典的MAPK级联反应包括三个细胞内蛋白激酶的序贯激活：首先胞外刺激通过各种机制激活MAPK激酶激酶(MAP3K)，随后活化的MAP3K磷酸化激活MAPK激酶(MAP2K)，最后，活化的MAP2K再次以磷酸化方式激活MAPK。MAPK家族的4个亚族由不同的胞外刺激活化，从而形成不同的MAPK信号通路，介导不同的生物学效应，其中ERK通路主要由生长因子、激素和促炎因子激活，而JNK通路和p38通路主要由细胞应激激活[16]。MAPK信号通路与多种纤维化疾病的发病机制密切相关，在肝纤维化的发病机制中，多种促纤维化因素可通过NOX源性的ROS调控MAPK信号通路。PDGF为HSCs最强有力的促有丝分裂剂，其可活化并上调HSCs NOX组分，促进ROS产生，ROS可进一步活化ERK和p38信号途径，促进HSCs增殖，应用NOX抑制剂DPI、抗氧化剂NAC或CGA则可抑制ERK与p38的活化和HSCs增殖[17,18]。Leptin是一种主要由脂肪细胞分泌的调节机体能量代谢的激素，其亦是重要的促肝纤维化因子，在原代培养的HSCs中，Leptin活化NOX，介导氧化应激形成和ERK1/2磷酸化，进而活化转录因子Sp1/Sp3同Ⅰ型胶原启动子的调控元件结合，促进Ⅰ型胶原分泌[19]。

4 NOX介导的氧化应激参与调控肝纤维化PI3K-AKT信号通路

磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)是一类能特异性催化磷脂酰肌醇(PI)肌醇环第3位羟基磷酸化的蛋白激酶，根据其结构、分布和活化机制可分为三类：classⅠ、classⅡ和class Ⅲ，目前研究最多的为classⅠPI3K。PI3K是由调节亚基p85和催化亚基p110组成的异源二聚体，PI3K活化后，其催化亚基将细胞膜上的PtdIns(4,5)P2(PIP2)转化为PtdIns(3,4,5)P3(PIP3)，PIP3作为第二信使进一步激活下游蛋白。AKT是PI3K下游信号通路的关键靶蛋白之一，目前已知的AKT家族由三个结构相似的亚型组成：AKT1(PKBα)、AKT2(PKBβ)和AKT3(PKBγ)，其结构中均含有PH结构域、激酶催化结构域和调控结构域三个功能区，PIP3与AKT的PH结构域相互作用，在膜上募集AKT并改变其构型，随后3-磷脂酰肌醇依赖性蛋白激酶(PDK)磷酸化AKT，活化的AKT移位至胞浆或胞核，通过对一系列底物蛋白磷酸化进而调控细胞应答[20]。PI3K-AKT信号通路与多种疾病的发病机制密切相关，NOX介导的氧化应激与PI3K-AKT信号通路间的交互调控影响多种疾病的进展。在肝纤维化的发病机制中，Cui等[21]研究表明在胆管结扎诱导肝纤维化的小鼠中，NOX1源性的ROS和失活的PTEN可正性调节AKT/FOXO4/p27(Kip1)信号通路，促进HSCs增殖和纤维化发生。最近Wu 等[22]研究表明HCV核心蛋白能通过NOX源性的ROS活化PI3K-AKT信号通路，进而抑制过氧化物酶体增殖物活化受体γ(PPARγ)的表达，促进HSCs活化和胶原沉积。He等[23]研究亦发现在HSCs中，熊果酸可通过抑制HSCs中NOX介导的氧化应激阻断leptin诱导的PI3K-AKT等多条信号通路的活化，进而发挥抗纤维化作用。

5 NOX介导的氧化应激参与调控肝纤维化NF-κB信号通路

NF-κB转录因子家族是一类广泛存在于真核细胞中的具有转录激活功能的蛋白质，其包括5位成员，分别为RelA(P65)、RelB、NF-κB1(P50/P105)、NF-κB2(P52/P100)和c-Rel，其中P105和P100分别为P50和P52的前体蛋白，在蛋白酶体作用下可形成P50和P52亚基。NF-κB转录因子家族在结构上均含有Rel同源区,该同源区包括二聚体化部位、IκB结合位点和DNA结合部位，其分别介导形成NF-κB二聚体、NF-κB与IκB蛋白的相互作用和NF-κB与DNA结合。NF-κB以同源二聚体或异源二聚体形式存在于胞质中，在静息状体下，NF-κB与抑制蛋白IκB在胞质中结合，无转录活性，当外来刺激活化IκB蛋白激酶(IKK)后，IKK磷酸化IκB蛋白并使其被蛋白酶降解，NF-κB与IκB分离并移位至胞核，进而调节多种基因的转录[24]。在肝纤维化的发病机制中，NOX介导的氧化应激可通过NF-κB信号通路介导肝脏炎症，促进纤维化发生。在华支睾吸虫病中，华支睾吸虫铁蛋白重链(CsFHC)通过活化HSCs的NOX、黄嘌呤氧化酶和诱导性一氧化氮合酶，导致自由基产生明显增加，增加的自由基促进胞质IKBa降解、增加NF-κB亚基P65和P50核移位，进而促进炎症细胞因子IL-6和IL-1β表达[25]。同时，在HCV感染过程中，HCV蛋白P27主要通过NOX4增加ROS产生，进而活化NF-κB和STAT3信号介导肝脏炎症[26]。在非酒精性脂肪性肝炎的发病机制中，抑制Leptin-NOX轴减少NF-κB介导的micro-RNA 21表达，增加抑制型Smad7表达，从而调节TGF-β信号转导与纤维化发生[27]。

综上所述，氧化应激是启动肝脏损伤和促进纤维化发展的主要机制之一，众多肝脏损伤因素可致肝脏氧化应激，而抑制氧化应激亦可部分改善肝纤维化，但需注意非特异性抗氧化剂的补充对于氧化应激介导的疾病可能是无效甚至是有害，因此，靶向病理性ROS的来源可能是更佳的治疗策略。NOX源性的ROS是众多肝脏损伤因素引起肝脏氧化应激的关键机制，而NOX介导的氧化应激亦参与调控多条重要的肝纤维化相关信号通路，因此，研究以NOX为特异性靶点的药物对于阻断肝纤维化有重要意义。

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国家自然科学基金资助项目(81260082)。

朱萱(E-mail：jyyfyzx@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.09.035

R575.2

A

1002-266X(2017)09-0100-04

2016-09-15)