任振敏　马东礼　黄锦桃　李朝红　谢富康

肌源干细胞(muscle-derived stem cells，MDSCs)存在于肌纤维的肌膜与基板之间，多处于静息期，在肌肉组织损伤并需要修复时大量增殖，它维持着肌肉组织的自我更新[1]。经研究发现，MDSCs在一定条件下可分化为骨骼肌细胞、平滑肌细胞[2]、甚至神经细胞[3]。MDSCs作为种子细胞，已用于压力性尿失禁[4]、杜氏肌营养不良[5]、心肌疾病[6]等较多疾病的治疗研究。本研究的目的就是体外培养MDSCs并初步探讨其成肌特性，为以后的基因治疗和组织工程奠定基础。

对象与方法

1.对象：新生3～5 d的SD乳鼠(中山大学动物实验中心提供)，DMEM/F12培养基(Gibco公司)，胎牛血清(FBS)(天津TBD公司)，Dispase酶(Roche公司)，Cardiac troponin T抗体(Santa Cruz公司)，胰蛋白酶、明胶、胶原酶I、DAPI、乙酰胆碱、α-银环蛇毒素试剂购于Sigma公司，PBS平衡液、结蛋白(desmin)单克隆抗体、骨骼肌肌球蛋白(skeletal myosin)抗体购于博士德公司。

生长培养基(DMEM/F12+20%FBS)、分化培养基(DMEM/F12+5%FBS)。

2.MDSCs的分离、纯化和培养：新生3～5 d的SD乳鼠，于无菌条件下取后肢骨骼肌，放在0.1 mol PBS液中，解剖显微镜下剔除筋膜、肌腱、血管和脂肪组织。将肌组织块用PBS冲洗3遍，用解剖剪将组织块剪成1 mm3大小，移入离心管中，再用PBS反复吹打3次，静置1 min后，弃去上层液体和漂浮组织。按每克肌肉2 ml混合消化酶(Dispase 2.4 U/ml，0.2% collagenase，2.5 mmol/L CaCl2)进行消化，37 ℃，1 h，加5倍体积的DFl2+20% FBS终止消化，反复吹打后经200目的不锈钢滤网过滤，离心，重悬。

反复差速贴壁法(preplate)纯化MDSCs：将细胞悬液吸入经明胶包被的培养瓶中培养2 h，贴壁的细胞为PPl(preplate1)；未贴壁的细胞悬液转入另一培养瓶中培养24 h，贴壁的细胞为PP2 (preplate2)；未贴壁的细胞悬液再转入另一培养瓶中培养24 h，贴壁的细胞为PP3(preplate3)；……