林苗苗 王文波 康文 高振 武晓莉 唐胜建 刘伟

辣椒素抑制体外培养瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的实验研究

林苗苗 王文波 康文 高振 武晓莉 唐胜建 刘伟

目的探讨辣椒素对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖能力、胶原表达及迁移能力的影响，为辣椒素治疗瘢痕疙瘩提供依据。方法取人瘢痕疙瘩9例，胶原酶消化获取瘢痕疙瘩成纤维细胞，用含有0.5 μg/L和5 μg/L辣椒素的DMEM培养液培养细胞，常规DMEM培养液培养作为对照。采用CCK-8法检测细胞增殖能力，流式细胞术检测周期变化，QPCR检测胶原和炎症因子等的表达水平，并以划痕实验检测细胞的迁移能力。结果辣椒素能抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖，阻滞细胞于G0/G1期，并抑制Ⅰ、Ⅲ型胶原和纤连蛋白的表达。此外，辣椒素还能降低瘢痕疙瘩细胞炎性因子白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-8（IL-8）及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的表达。但是，辣椒素对细胞的迁移能力没有影响。结论辣椒素能抑制体外培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖能力，并抑制其胶原和炎性因子等的表达。

瘢痕疙瘩成纤维细胞辣椒素增殖

瘢痕疙瘩（Keloid）是病理性瘢痕，是由于以成纤维细胞为主的细胞过度增殖，并分泌大量的细胞外基质而引起的[1]。此外，瘢痕疙瘩病灶内存在大量炎症因子和生长因子的分泌、聚集，如TGF-β1、IL-6、IL-8及TNF-α等[2]，可以进一步促进细胞增殖和细胞外基质的合成、沉积，导致组织纤维化和瘢痕疙瘩形成。因此，减少瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖，降低炎症因子的表达，可能是治疗瘢痕疙瘩的重要方向。辣椒素药理作用广泛，具有抗炎、止痒、镇痛及抗肿瘤等作用[3-5]，并能抑制增生性瘢痕成纤维细胞的增殖和胶原合成[6]，但其对瘢痕疙瘩成纤维细胞的作用尚不明确。本实验主要就辣椒素对瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖、胶原与炎症因子等的表达以及细胞迁移的影响开展研究，为辣椒素治疗瘢痕疙瘩提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 标本收集

9例瘢痕疙瘩标本来源于上海第九人民医院整复外科瘢痕疙瘩手术患者，获患者知情同意。患者年龄21～64岁；其中女性6名，男性3名；前胸部4例，肩部3例，耳垂部2例。具体取材标准：处于增生活跃期、高出皮肤、质地较硬、局部充血，并有明显的毛细血管扩张，伴有明显瘙痒或疼痛症状；瘢痕疙瘩无破损和感染，未接受过任何相关治疗。

1.2 主要试剂及仪器

辣椒素（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；胎牛血清FBS（ScienCell，美国）；胶原酶NB4（上海史瑞克生物科技有限公司）；DMEM高糖培养液（HyClone，美国）；青霉素、链霉素、两性霉素B（Gibco，美国）；CCK-8（Dojindo，日本）；胰蛋白酶（Gibco，美国）；二甲亚砜（上海沪试化工有限公司）；Trizol（Ambion，美国）；AMV逆转录试剂盒（Promega，美国）。

酶联免疫检测仪（Thermo，美国）；流式细胞仪（BD，美国）；PCR仪（Biometra，德国）。

1.3 瘢痕疙瘩成纤维细胞的分离和培养

获取瘢痕疙瘩成纤维细胞[7]，以1×104cells/cm2的密度接种至100 mm培养皿内，置于37℃、5% CO2、饱和湿度培养箱中进行培养，每2天换液一次。待细胞融合至80%时进行传代。为避免个体差异，将3位患者的细胞混合后作为一个混合细胞样本，共建立3个细胞样本。取体外培养的第2代细胞用于后续实验。

1.4 实验分组

瘢痕疙瘩成纤维细胞分别以含0.5 μg/L和5 μg/L辣椒素培养液进行干预（实验组），观察细胞的增殖、胶原及周期变化；以不含辣椒素的常规培养液培养为对照组。各组至少重复3次。

1.5 检测指标

1.5.1 辣椒素对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的影响

[7]的方法，将瘢痕疙瘩成纤维细胞以0.5×104cells/mL的密度接种到96孔培养板，依照分组进行相应干预，培养1、3、5、7 d。根据CCK-8试剂盒的操作说明，每孔内加入10 μL的CCK-8试剂，孵育2.5 h，酶联免疫检测仪于450 nm波长处测定其光吸收值。

1.5.2 细胞周期实验

以上述浓度的细胞悬液接种到100 mm的培养皿上，培养5 d后收集细胞，70%乙醇固定，4℃过夜，PBS洗涤1次，加入20 μL RNase，避光加PI染液，冰浴30 min，染色后过滤。流式细胞仪检测分析，记录细胞样品的G0/G1期、G2/M期、S期细胞百分比。

1.5.3 定量RT-PCR检测胶原和炎症因子的表达

上述浓度的细胞悬液接种到100 mm的培养皿上，培养48 h后，Trizol提取细胞RNA，紫外分光计核算纯度，A260/A280比值为1.8～2.0。每个标本以1.5 μg总RNA为模板，按AMV逆转录试剂盒配制20 μL反应体系：5×Buffer 4 μL，10 mM dNTP 2 μL，200 ng/μL Oligo dT-Adaptor Primer 1 μL，40 U/μL RNase抑制剂0.5 μL，5 U/μL AMV逆转录酶0.5 μL，反应体系加水配平至20 μL。反应条件：30℃10 min，42℃60 min，99℃5 min，5℃5 min。

cDNA在qPCR仪中扩增，反应体系：ddH2O 7 μL，MIX 10 μL，cDNA 1 μL，前引物1 μL，后引物1 μL。反应条件：95℃5 min、95℃30 sec、58℃30 sec、72℃45 sec、72℃10 min为一个循环，共40个循环。管家基因GAPDH为内参照（表1）。

1.5.4 细胞划痕实验

取处于对数生长期的瘢痕疙瘩成纤维细胞，以1×105cells/mL的密度接种到六孔培养板中，每孔接种3 mL，待细胞长满，在每孔中央作划痕，PBS洗涤2次后，倒置显微镜下拍照记录细胞划痕两侧的面积。培养48 h后，拍照记录干预后细胞划痕两侧的面积。根据公式计算细胞迁移率。

1.6 统计学分析

所有数据以（x±s）表示，以SPSS 19.0软件进行统计分析，采用单因素方差分析，两两比较采用Post-hoc法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 辣椒素对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的影响

辣椒素干预的第5和第7天，实验组瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖受到抑制，与对照组差异明显（P＜0.05）；辣椒素浓度越高抑制作用越明显，两个实验组之间也存在显著差异（P＜0.05）（图1A）。

2.2 辣椒素对瘢痕疙瘩成纤维细胞周期的影响

实验组G0/G1期瘢痕疙瘩成纤维细胞明显增加，0.5 μg/L组和5 μg/L组分别为（87.78%±1.85%）和（88.15%±0.76%），对照组为（83.66%±1.28%）。两实验组与对照组均有统计学差异（P＜0.05），两实验组间未见明显差异（P＞0.05）（图1B）。

2.3 辣椒素抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的胶原相关mRNA的表达

实验组瘢痕疙瘩成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原和Fibronectin的表达量均有不同程度的降低。两实验组之间，以及与对照组之间，Ⅰ型胶原的表达量均存在显著差异（P＜0.05）；Ⅲ型胶原和Fibronectin的表达量，实验组与对照组相比差异显著（P＜0.05），但两实验组间无统计学差异（P＞0.05）；而α-SMA的表达

量没有显著变化，组间无差异（P＞0.05）（图2）。

2.4 辣椒素抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的炎性因子mRNA的表达

实验组瘢痕疙瘩成纤维细胞的IL-6、IL-8及TNF-α的表达量均降低，与对照组存在显著性差异（P＜0.05），两实验组间无显著差异（P＞0.05）；TGF-β1的表达无显著变化，组间无差异（P＞0.05）（图3）。

2.5辣椒素对瘢痕疙瘩成纤维细胞迁移的影响

0.5μg/L和5 μg/L组的细胞迁移率分别为（90.585%±7.279%）和（88.464%±3.714%），两实验组之间无明显差异，与对照组（91.164%±3.704%）比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（图4）。

表1 PCR引物序列Table 1Primers for PCR

图1 辣椒素对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和周期的作用Fig.1Effect of capsaicin on proliferation and cell cycle of keloid fibroblasts

图2 辣椒素对瘢痕疙瘩成纤维细胞胶原相关mRNA表达的作用Fig.2Effectofcapsaicinon collagen-associated mRNA expression in keloid fibroblasts

图3 辣椒素对瘢痕疙瘩成纤维细胞炎性因子mRNA表达的作用Fig.3Effect of capsaicin on mRNA expressionofinflammatory cytokines in keloid fibroblasts

图4 辣椒素影响瘢痕疙瘩成纤维细胞迁移的形态学观察及迁移率半定量分析Fig.4Morphological observation of migration of keloid fibroblasts interfered by capsaicin and semi-quantitative analysis of mobility

3 讨论

瘢痕疙瘩，以超过原始皮损边缘向正常组织扩展和过度胶原沉积为特征，无自愈倾向，被认为是皮肤的“良性肿瘤”[8-9]。成纤维细胞的过度增殖，分泌过多的胶原与细胞外基质，是瘢痕疙瘩形成的病理学基础[1]。瘢痕疙瘩病灶内大量炎症因子的异常表达和聚集，也是导致病情持续发展的重要原因[2]。因此，抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、胶原等基质的合成，以及降低炎症因子的分泌，是治疗瘢痕疙瘩研究的重要策略之一。目前，临床上主要采用局部注射抗肿瘤药物和糖皮质激素等，但长期使用会产生一定的副作用[10]。

研究表明，辣椒素能抑制增生性瘢痕成纤维细胞的增殖和胶原合成[6]。瘢痕疙瘩与增生性瘢痕同属于病理性瘢痕，发病机制和治疗方案相似，因此辣椒素可能同样可以抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖。我们用高低两种浓度的辣椒素干预瘢痕疙瘩成纤维细胞的体外培养过程，发现辣椒素能抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖，并使其细胞周期也受到抑制，能阻滞细胞于G0/G1期，表明辣椒素能抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖。

实验中，我们发现辣椒素可以抑制与纤维化相关的胶原分子的表达。辣椒素可以抑制多种组织纤维化，包括肝纤维化[11]及增生性瘢痕[6]，提示辣椒素还可能通过抑制纤维化来治疗瘢痕疙瘩。

瘢痕疙瘩的发病过程中，炎症因子具有重要的促进作用，可以调节细胞外基质的合成，促进细胞的增殖，并调节细胞的凋亡[12]。已有大量文献表明辣椒素具有抗炎作用。Kim等[13]证实辣椒素可以通过抑制巨噬细胞内部IkB-a的降解，从而降低炎症反应。Colpaert等[14]采用皮下注射辣椒素，24 h后观察到其对接种分枝杆菌丁酸菌引起的大鼠膝关节炎症有明显的抗炎作用。Zhukova等[15]在健康成年大鼠的皮下注射辣椒素，2周后取出胸腺，对其结构和囊下区的细胞组成进行相关检测，发现辣椒素能调节神经肽的水平，参与自身免疫的调控，从而达到抗炎作用。本实验证实，辣椒素可以抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞炎性因子IL-6、IL-8及TNF-α的表达，提示辣椒素对瘢痕疙瘩的潜在治疗作用可能还包括对炎症因子的调控。

本实验结果显示，辣椒素对瘢痕疙瘩成纤维细胞的迁移没有抑制作用。成纤维细胞的迁移与TGF-β1密切相关，TGF-β1不仅是促进伤口愈合的关键因素，也是促进细胞迁移的重要生长因子[16]。有研究报道，TGF-β1可以促进各种体外培养的肿瘤细胞的迁移，包括肺癌细胞[17]、乳腺癌细胞[18]及食管癌细胞[19]等，而且对成纤维细胞的迁移也发挥了重要的作用。Wu等[20]在研究FK506抑制TGF-β1对瘢痕疙瘩成纤维细胞胶原表达和TGF-β/Smad信号传导的增强作用中已经证实，TGF-β1能显著增强瘢痕疙瘩成纤维细胞的迁移。而本实验结果显示，辣椒素对瘢痕疙瘩成纤维细胞TGF-β1的表达没有作用，这可能也是辣椒素不影响瘢痕疙瘩成纤维细胞迁移的原因之一。

综上所述，本实验结果显示，辣椒素对细胞增殖、细胞外基质表达均有抑制作用，同时还可以通过抑制相关炎性因子的表达，起到抗炎的作用。这些结果提示，辣椒素可能是潜在的瘢痕疙瘩治疗药物，值得对相关内容进行更为深入地研究。

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Inhibitory Effect of Capsaicin on the Proliferation of Keloid Fibroblasts Cultured in Vitro

ObjectiveTo explore the effect of capsaicin on inhibiting collagen expression,proliferation and migration ability of keloid fibroblasts in vitro and thus to provide scientific basis for clinical application of capsaicin in treatment of keloid.MethodsThe keloid tissues were harvested from 9 patients and digested with 0.3%collagenase to extract keloid fibroblasts.These cells were treated with different concentrations of capsaicin(0.5 μg/L and 5 μg/L)as the experiment group or without capsaicin treatment as the control group.CCK-8 assay was used to evaluate cell proliferation.Flow cytometry was also employed to evaluate cell cycle.Q-PCR assay was used to examine the gene expression levels of collagen and other extracellular matrices.In vitro wound scratch was also used to investigate cell migration ability.ResultsCapsaicin inhibited the proliferation of keloid fibroblasts,resulting in relative blockade of cell cycle in G0/G1 phase.It also inhibited the gene expression of collagensⅠandⅢand fibronectin.In addition,Capsaicin also inhibited the gene expression of IL-6,IL-8 and TNF-α,but had no effect on cell migration.ConclusionCapsaicin could inhibit the proliferation and gene expression of collagen and inflammatory cytokines of cultured fibroblasts in vitro.

Keloid;Fibroblasts;Capsaicin;Proliferation

R619+.6

A

1673－0364（2017）01－0005－05

LIN Miaomiao1,WANG Wenbo2,3,KANG Wen2,GAO Zhen2,WU Xiaoli2,TANG Shengjian1,LIU Wei2,3．
1 Plastic Surgery Research Institute,Weifang Medical College,Weifang 261042,China;2 Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China;3 Shanghai Key laboratory of Tissue Engineering,Shanghai 200011,China.Corresponding author:LIU Wei(E-mail:liuwei_md@126.com).

2016年10月11日；

2016年12月27日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2017.01.002

261042山东省潍坊市潍坊医学院整形外科研究所（林苗苗，唐胜建）；200011上海市上海交通大学医学院附属第九人民医院整复外科（王文波，康文，高振，武晓莉，刘伟）；上海组织工程研究重点实验室（王文波，刘伟）。

刘伟（E-mail：liuwei_md@126.com）。