赵莉娟 郑江红 柳向东 茅广宇 邓辰亮 杨松林

iRGD-外泌体-阿霉素抑制恶性黑色素瘤体外增殖的研究

赵莉娟 郑江红 柳向东 茅广宇 邓辰亮 杨松林

目的探讨应用iRGD-外泌体-阿霉素抑制人恶性黑色素瘤细胞系A375体外增殖的有效性及其靶向性。方法体外转染iRGD，并提取外泌体，通过电穿孔包裹阿霉素，利用流式细胞仪检测iRGD-外泌体-阿霉素对A375细胞的亲和力，并对iRGD-外泌体-阿霉素抑制A375细胞的增殖能力进行分析。结果iRGD-外泌体-阿霉素与A375细胞的结合率高于空白转染-外泌体-阿霉素；iRGD-外泌体-阿霉素可明显抑制A375细胞的增殖，空白转染-外泌体-阿霉素未观察到明显的抑制情况。结论iRGD-外泌体-阿霉素能通过靶向作用于A375细胞，并抑制其增殖。

恶性黑色素瘤靶向治疗外泌体阿霉素

恶性黑色素瘤（Malignant melanoma，MM）是起源于皮肤黑色素细胞的高度恶性肿瘤，占体表恶性肿瘤的7%～20%，仅次于皮肤鳞癌和基底细胞癌，居第三位[1]。恶性黑色素瘤的发病机制尚未明确，黑色素细胞痣恶变、病毒感染、紫外线照射等多种因素均与其发生有关[2]，传统的手术及放、化疗治疗效果有限。近年来，外泌体作为一种包裹药物的特异性载体，可包裹阿霉素等化疗药物，靶向作用于恶性黑色素瘤细胞，降低传统化疗的副作用[3]。其靶向治疗优势明显[4]，免疫原性低、无毒副作用；且来源广，具有磷脂双分子层结构，易于与靶细胞的细胞膜融合[5]；分子结构小，纳米级分子量（10～100 nm），可避免单核细胞的吞噬作用，且易于穿透肿瘤组织毛细血管向深层组织浸润[6]。本实验根据iRGD可与恶性黑色素瘤表面的αν整合素特异性结合的原理，体外设计iRGD-外泌体，经电穿孔包装阿霉素后靶向结合恶性黑色素瘤细胞表面，经胞吞作用将阿霉素摄入肿瘤细胞内，直接有效地起到抗肿瘤效果，并减少对正常细胞的损伤。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

人恶性黑色素瘤细胞系A375（以下简称为A375），人肾上皮细胞系293T（以下简称为293T），均购于中科院上海细胞所；胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司）；DMEM培养液、胰酶、PBS（江苏凯基生物技术股份有限公司）；外泌体提取试剂（美国Invitrogen公司）；阿霉素（美国Sigma公司）；荧光染剂DIO（美国Invitrogen公司）。

电穿孔仪（美国Invitrogen公司）；FACS Calibur型流式细胞仪（美国Becton Dickinson公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

含10%小牛血清的DMEM培养基在37℃、5% CO2培养箱中培养293T细胞，待细胞融合至85%～90%时，传代培养，收集第6～8代293T细胞用于下一步实验研究。

1.2.2 质粒构建与细胞转染

293T细胞接种至六孔板，细胞85%～90%融合时，按Lipofectamine 2000说明书配置溶液A：240 μL无血清DMEM+10 μL Lipofectamine2000；溶液B：233 μL无血清DMEM+17 μL pcDNA3.1（+）-hLAMP2b-CysiRGD质粒。质粒序列：TGCTGTAGAGGTGACAAAGGCCCAGATTGTGGTGGATCATGC。将A、B在5 min内混匀，室温放置20 min后，每孔各加入2 mL DMEM，A、B混匀后悬滴加入培养液中，标记为空白转染组（对照组）、iRGD转染组（实验组）。摇动培养板轻轻混匀，放置在37℃、5%CO2培养箱中培养。6 h后更换含10%胎牛血清的FBS培养液，24 h后收集上清，提取外泌体。

1.2.3 外泌体的提取

细胞转染收集上清，2 000 g离心30 min，离心后收集1 mL上清，加入500 μL Total Exosome Isolation reagent，4℃过夜，10 000 g 4℃离心1 h，弃上清，分别获得空白转染-外泌体（blank-exo，对照组）、iRGD-外泌体（iRGD-exo，实验组），沉淀，-20℃保存。

1.2.4 药物包装

将0.2 μL外泌体+50 μg阿霉素用buffer混匀（200 μL体系），常温下1 KV、20 ms电穿孔后4℃保存，分别获得空白转染-外泌体-阿霉素（blankexo-dox，对照组）与iRGD-外泌体-阿霉素（iRGD-exo-dox，实验组）。

1.2.5iRGD的RT-PCR检测

取冻存外泌体抽提RNA，并将其转合成为cDNA，进行PCR反应，GAPDH设为管家基因。PCR反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性40 sec，40℃退火40 sec，72℃延伸1 min。将EP管放入仪器扩增，循环35次；72℃延伸10 min。4℃储存。用1%琼脂糖凝胶进行电泳，并检测拍照。

GAPDH引物序列：上游5’-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3’，下游5’-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3’；iRGD引物序列：上游TCGATGTTAGACCTGGAAATAGTGGTGCTGTG，下游CCGGCACAGCACCACTATTTCCAGGTCTAACA。

1.2.6A375细胞染色

用含10%胎牛血清的FBS培养液在37℃、5% CO2培养箱中培养两组A375细胞，待细胞65%～70%左右融合时，使用试剂Dio进行细胞染色。使用DMSO配置成1 mM浓度作为储存液，PBS稀释200倍至5 μM工作液，将稀释好的Dio染料悬滴加入A375细胞培养皿中，37℃、5%CO2孵育1 h。PBS溶液清洗染剂，在细胞培养皿中加入10 mL含10%胎牛血清的FBS培养液。

1.2.7 外泌体结合

将获取的blank-exo-dox、iRGD-exo-dox悬液分别悬滴加入已Dio染色的A375细胞培养皿中，37℃、5%CO2孵育1 h后，PBS清洗3次，去除多余的外泌体，分别得到A组（blank-exo-dox-A375，实验组）、B组（iRGD-exo-dox-A375，对照组）细胞，分别进行流式细胞仪检测和细胞增殖检测。

1.2.8 流式细胞仪检测

胰酶消化后分别获取A组和B组细胞悬液，1 000 g离心3 min，弃上清，获取细胞沉淀，将两组细胞沉淀分别加入0.9%NaCl，稀释至1 mL，用于流式细胞仪检测，并记录数据。

1.2.9 细胞增殖检测

取96孔板，分别用于检测A、B组细胞，每孔加入100 μL的A或B细胞悬液（1×104个/孔）。将培养板置于37℃、5%CO2的条件培养箱中分别孵育0、24、48、72、96 h，向待测孔加入10 μL CCK-8溶液。每组细胞、每个时间点取3个样品检测，将培养板在培养箱内孵育1～4 h。用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。

2 结果

2.1iRGD-外泌体的鉴定

我们通过RT-PCR对iRGD mRNA的表达水平进行评估。结果显示相较于blank-exo，iRGD-exo具有较高水平的iRGD mRNA表达（图1）。

图1RT-PCR检测iRGD的mRNA表达Fig.1The mRNA expression of iRGD detected by RT-PCR

2.2iRGD-外泌体-阿霉素靶向于A375细胞的研究

为了确认iRGD是否靶向于A375细胞上的αν整合肽，我们将blank-exo-dox、iRGD-exo-dox悬液分别悬滴加入已Dio染色的A375细胞培养皿中。流式细胞检测证实，iRGD-exo-dox与A375细胞的结合效率高于blank-exo-dox（分别为41.5%、8.4%），表明iRGD可特异性结合于A375细胞表面的αν整合素（图2）。

图2 流式细胞仪检测结果Fig.2Results of flow cytometry

2.3iRGD-外泌体抑制A375细胞的效果

使用iRGD-exo-dox与blank-exo-dox对A375细胞进行24、48、72、96 h存活能力分析。CCK-8检测显示iRGD-exo-dox抑制了细胞的增殖，但在blank-exo-dox中并没有观察到明显的抑制情况，表明iRGD-exo-dox对A375细胞的增殖有明显的抑制作用（图3）。

图3A375细胞增殖曲线Fig.3The curve of cell proliferation in A375 cells

3 讨论

近年的研究认为，靶向治疗可直接高效地起到抗肿瘤作用，但靶向治疗的瓶颈在于发现的相关肿瘤的细胞表面特异性抗原有限。目前已发现的恶性黑色素瘤标志物有：黑色素瘤细胞分化抗原糖蛋白（Glycoprotein，gp）100、黏附分子L1-CAM、人内源性逆转录病毒K包膜蛋白（HERV-K）等[7]。这些标志物在多种实体瘤，如恶性黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌中均有过度表达，而在正常细胞中表达量极低，它们的相对特异性表达是当前治疗相关肿瘤的重要靶点[8-13]。Krishnamurthy等[7]利用HERV-K的肿瘤特异性，构建相关嵌合抗原受体修饰的T细胞（CAR-T），特异性识别HERV-K并与其结合，起到了限制肿瘤生长的效果。

αν整合素是细胞表面的一种黏附分子，主要通过介导细胞与细胞外基质的黏附作用，而影响细胞的生物学行为，在正常细胞表面呈低表达水平，同样在多种实体瘤细胞表面呈高表达水平，与肿瘤的侵袭、转移密切相关[14]。乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、恶性黑色素瘤等肿瘤细胞表面均过度表达αν整合素，Tian等[3]利用αν整合素表达的相对特异性，联合设计体内和体外实验，将化疗药物靶向作用于乳腺癌细胞，取得显著疗效。本实验针对恶性黑色素瘤细胞表面αν整合素的高水平表达，体外构建iRGD-exo-dox颗粒，将阿霉素特异性作用于恶性黑色素瘤细胞（A375细胞），观察对恶性黑色素瘤体外增殖的影响。

外泌体是由内皮细胞和造血干细胞产生的磷脂双分子层囊泡，可经胞吞作用被细胞摄取，是运输化疗药物的理想载体[15]。与传统化疗方法相比，经外泌体转载的化疗药物可特异性作用于肿瘤细胞，其纳米级（10～100 nm）结构可避免体内单核巨噬细胞的吞噬[6]，可以提高抗肿瘤的效能；同时还能避免对正常细胞的损伤，降低化疗的副作用。目前，大量的化疗药物因剂量依赖性副作用而导致应用受限。阿霉素是常见的临床化疗药物，对肿瘤生长控制有显著效果，但同时也可广泛作用于全身正常细胞，而引起心血管系统损伤[16]。本研究在体外构建运载化疗药物（阿霉素）的载体，通过载体与细胞之间的靶向结合直接将药物作用于肿瘤细胞，安全高效地遏制恶性黑色素瘤的增殖。我们在体外培养293T细胞，待细胞融合率达80%～90%时，体外转染iRGD，提取外泌体，通过电穿孔包裹阿霉素，利用流式细胞仪检测iRGD-外泌体-阿霉素对A375细胞的亲和力，并对iRGD-外泌体-阿霉素抑制A375细胞的增殖能力进行分析。结果显示，iRGD-外泌体-阿霉素与A375细胞的结合率高于空白转染-外泌体-阿霉素，且iRGD-外泌体-阿霉素可明显抑制A375细胞的增殖，而空白转染-外泌体-阿霉素未观察到明显的抑制作用，说明表达iRGD蛋白的外泌体携载阿霉素能更有效地抑制细胞增殖，起到抗肿瘤作用。

近年来，恶性黑色素瘤的发病率逐渐增加，80%皮肤癌的死亡与恶性黑色素瘤相关。常隐匿起病，但进展速度快，早期易发生转移，恶性度高，预后差，生存中位数只有6个月左右[17]。传统的手术切除、放化疗对恶性黑色素瘤的治疗效果均不明显，且截肢术及放化疗的毒副作用增加了患者的痛苦。应用外泌体作为药物载体的靶向治疗在提高抗肿瘤效能的同时，也降低了患者放化疗的痛苦。外泌体来源广、免疫原性低，在靶向治疗领域中具有广阔的应用前景。相信随着更为深入的研究，有望为包括恶性黑色素瘤在内的肿瘤治疗，开辟一条高效可行的新途径。

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The Inhibition of iRGD-Exosomes-Doxorubicin on the Proliferation of Malignant Melanoma in Vitro

ObjectiveTo investigate the effect and targeting of iRGD-exosomes-doxorubicin(iRGD-exo-dox)on the inhibition of A375 cell line.MethodsThe exosomes were extracted from the iRGD-transfected A375 cells.The doxorubicin was wrapped by electroporation.Flow cytometry was used to detect the affinity of iRGD-exo-dox to A375 cells.The ability of iRGD-exo-dox on inhibiting the proliferation of A375 cells was analyzed.ResultsThe affinity of iRGD-exo-dox to A375 cells was higher than the blank-exo-dox.The proliferation of A375 cells was obviously inhibited by iRGD-exo-dox.The inhibition effect was not observed in blank-exo-dox group.ConclusioniRGD-exo-dox can inhibit the proliferation of A375 cells by targeting function.

Malignant melanoma;Targeted therapy;Exosome;Doxorubicin

R739.5

B

1673－0364（2017）01－0025－04

ZHAO Lijuan,ZHENG Jianghong,LIU Xiangdong,MAO Guangyu,DENG Chenliang,YANG Songlin．
Department of Plastic Surgery, Shanghai Sixth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University,Shanghai 200233,China.Corresponding author:YANG Songlin(E-mail:slyang@sjtu.edu.cn).

16日；

2017年1月22日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2017.01.007

200233上海市上海交通大学附属第六人民医院整形外科。

杨松林（E-mail：slyang@sjtu.edu.cn）。