高寒春 姚立红 王超 郑丽舒

100052北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所高寒春、姚立红对本文同等贡献

寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)是一种由蚊子传播的虫媒病病毒，可以导致新生儿“小头症”。该病毒于1947年最早发现于乌干达寨卡丛林的恒河猴体内，1956年研究者通过喂食小鼠和猴子感染ZIKV的伊蚊，成功地复制了ZIKV的感染[1]，1952年第一次从人体分离出来[2-3]。

ZIKV属于黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(Flavivirus)，有包膜的球状病毒，直径40～70 nm。基因组长度约10.8 kb，为单股正链RNA[4]。只有一个开放阅读框(ORF)，编码一个多聚蛋白。多聚蛋白在宿主细胞内表达后，剪切加工成3个结构蛋白，即衣壳蛋白(Capsid protein，C)、膜蛋白前体/膜蛋白(Premembrane/Membrane protein，prM/M)和包膜蛋白(Envelope protein，E)，以及7个非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5)[5]。其中E蛋白与病毒进入、组装和出芽相关[6]。

杆状病毒载体表达系统(BEVS)是当今基因工程领域4大表达系统之一，安全性高，外源基因克隆容量大，重组病毒易于筛选，不但具备翻译后加工修饰系统还有高效表达外源基因的能力[7-8]。本研究采用BEVS成功表达了ZIKV E蛋白，为ZIKV E蛋白功能研究及疫苗研发奠定了基础。

1 材料与方法

1.1细胞及表达载体sf9细胞和pFastBacl表达载体由本科室保存。

1.2主要试剂基因组DNA提取试剂购自Qiagen公司；蛋白质Marker购自Fermentas公司；MAX Efficiency DH10BacTM 感受态细胞，PureLinkTM HiPure Plasmid Miniprep Kit，CellfectinⅡ转染试剂，昆虫细胞培养基sf900-Ⅱ SFM均购自Invitrogen公司；ZIKV E蛋白兔血清抗体，HRP标记的山羊抗兔IgG均由北京生物制品所赠送；FITC标记的羊抗鼠IgG 购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3重组杆状病毒转移载体的构建根据sf9昆虫细胞密码子使用偏性，参考GenBank中ZIKV E蛋白的基因序列，在不改变氨基酸序列的前提下由Invitrogen 公司进行优化合成，序列两端分别添加BamHI和EcoRI限制性酶切位点。将优化合成的目的片段与pFastBac1载体连接、转化，提取质粒，经BamHI和EcoRI双酶切鉴定，并送Invitrogen公司测序。将鉴定正确的质粒命名为pFB1-E。

1.4重组杆状病毒骨架质粒的构建转移载体pFB1-E 转化感受细态胞DH10Bac，经抗生素和蓝白斑筛选，挑取阳性克隆，采用通用引物M13F和M13R进行PCR鉴定。反应条件为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 5 min，30 cycle；72 ℃ 10 min。鉴定正确的重组杆状病毒骨架质粒命名为rBacmid-E。以pFB1转化DH10Bac得到质粒rBacmid-N为空白对照。

1.5重组杆状病毒的包装及滴度测定将rBacmid-E和rBacmid-N分别转染sf9细胞，阴性对照为不含质粒的等量转染试剂，镜下观察。细胞7 d后明显病变，收集细胞经3次反复冻融，离心后上清为P1代重组杆状病毒，命名为rBac-E-P1。rBac-E-P1按MOI=0.1感染对数生长期的sf9细胞，出现明显细胞病变时得到P2代病毒，命名为rBac-E-P2，同法获得P3代病毒。rBacmid-N转染sf9 细胞重组病毒rBac-N为空白对照。噬斑形成法，检测重组病毒rBac-E-P3病毒滴度。

1.6检测重组杆状病毒E基因插入感染rBac-E和rBac-N的sf9细胞的病毒基因组为模板，M13F、M13R为引物进行PCR，反应条件同前，产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.7E蛋白检测

1.7.1 间接免疫荧光检测:rBac-N 和rBac-E分别感染96 孔板中sf9 细胞，72 h后，甲醇固定细胞，一抗为鼠ZIKV E蛋白单克隆抗体(1∶500稀释)，二抗为FITC 标记的山羊抗鼠IgG(1∶200稀释)，显微镜下观察荧光。

1.7.2 Western blot检测:rBac-N和rBac-E分别感染sf9 细胞3 d，反复冻融细胞3次，离心，弃上清，200 μl PBS 重悬沉淀，取20 μl上样，经SDS-PAGE后，电转至硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶封闭过夜，一抗为ZIKV E蛋白兔抗血清(1∶500稀释)，二抗为HRP 标记的山羊抗兔IgG(1∶5 000稀释)，TMB显色。

2 结果

2.1转移载体的鉴定转移载体质粒pFB1-E经BamHI和EcoRI双酶切鉴定，可见1 518 bp的E基因片段，大小与预期相符。测序结果与E基因序列同源性为100%。

2.2重组杆状病毒骨架质粒的鉴定rBacmid-E和Rbacmid-N的PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，基因片段大小3 830 bp(2 300 bp+1 530 bp)和2 300 bp符合预期，Bacmid质粒上成功整合E基因。

2.3重组杆状病毒的包装及病毒滴度转染3 d后，显微镜下观察可见，与阴性对照相比，rBacmid-N、rBacmid-E转染的sf9细胞变大、变圆，细胞间距增大；7 d后，大部分细胞破碎脱落，见图1。经噬斑形成法检测，第3代重组病毒rBac-E-P3滴度为2.58×105pfu/ml。

图1 转染后sf9细胞病变效应(100×)Fig.1 Cytopathic effect of transfected sf9 cells(100×)

2.4重组杆状病毒E基因插入提取感染rBac-N、rBac-E 的sf9细胞上清中病毒基因组DNA，以M13F、M13R为引物经PCR扩增鉴定，产物大小与预期一致，分别为2 300 bp和3 830 bp，见图2，成功得到ZIKV E基因重组杆状病毒，命名为rBac-E。

注：M，DNA marker DL15000；1，rBacmid-E基因的PCR产物； 2，rBacmid-N基因的PCR 产物图2 重组杆状病毒E基因的PCR 鉴定Note: M，DNA marker DL15000; 1，PCR product of rBacmid-E;2， PCR product of rBacmid-NFig.2 Identification of E gene of rBac-E by PCR

2.5E蛋白的表达

2.5.1 间接免疫荧光检测:有强烈的绿色荧光出现的是感染rBac-E的sf9细胞，而感染rBac-N的阴性对照无荧光，见图3。说明sf9细胞经重组杆状病毒rBac-E感染后，ZIKV的E蛋白被成功表达。

注：A, rBac-N 感染的sf9 细胞；B, rBac-E 感染的sf9 细胞；图3 间接免疫荧光检测E 蛋白的表达Note: A, sf9 cell infectioned by rBac-N; B, sf9 cell infectioned by rBac-EFig.3 IFA of expression of E protein

2.5.2 Western blot检测:感染rBac-N的sf9细胞裂解上清中未见特异性条带，感染rBac-E的sf9细胞裂解上清在相对分子质量55×103处有特异性反应条带出现，见图4。说明E蛋白在rBac-E感染的sf9细胞中成功表达。

注：M,蛋白质marker；1,rBac-N感染的sf9 细胞；2,rBac-E 感染的sf9 细胞图4 Western blot 检测E蛋白的表达Note: M, Protein marker; 1, sf9 cell infectioned by rBac-N; 2, sf9 cell infectioned by rBac-EFig.4 Western blot of expressed E protein

3 讨论

ZIKV于1947年被发现，1952年首次从人体分离出来[2-3]，该病毒在2007年开始出现暴发流行[3，9]，2015年和2016年，ZIKV在巴西引起了疫情，WHO将该疫情列为国际紧急卫生事件[10]。目前认为ZIKV通过伊蚊传播，埃及伊蚊为主要传播媒介[11]，同时也可能存在其他传播方式。近日，Tetro等[12]在母亲体内和胎儿羊水中均检测出ZIKV核酸，说明其可能垂直感染胎儿。此外，ZIKV还可通过血液接触或性接触传播[13-15]。

当ZIKV入侵宿主细胞时，E蛋白与细胞表面的受体结合诱导病毒包膜与细胞膜融合，核衣壳通过受体介导的內吞作用进入细胞质[16]。研究表明，ZIKV E蛋白与其他黄病毒属病毒具有较高的同源性[17]。我国科研人员已经确定了ZIKV E蛋白的晶体结构，发现其具有明确的3个结构域，与其他黄病毒属病毒类似[18]。ZIKV E蛋白的结构域III是特异性中和抗体的结合位点，是ZIKV抗体及疫苗研发的重要靶点[19]。

美国华尔特里德陆军研究所针对ZIKV包膜prM和E蛋白研发出ZIKV灭活疫苗，免疫接种的8只恒河猴均产生了特异性抗体，感染ZIKV后，在血液、尿液及其他分泌物中均未检测到ZIKV[20]。美国Inovio 公司和韩国Gene One Life Science 公司合作开发了ZIKV DNA疫苗GLS5700。法国Valneva 公司、日本Takeda公司、巴西免疫生物技术研究所、美国NewLink公司等也已展开ZIKV灭活疫苗的研发。哈佛大学构建了表达ZIKV E蛋白的52型恒河猴重组腺病毒载体，免疫小鼠后可产生中和抗体，且在恒河猴体内产生较强的细胞免疫应答和体液免疫应答[21]。此外，美国Protein Sciences公司利用基因工程杆状病毒昆虫细胞表达技术平台与阿根廷Sinergium公司合作，正在进行ZIKV重组E蛋白疫苗的研发。综上所述，全球有30多个机构在进行ZIKV疫苗的研发，涉及到灭活疫苗、嵌合病毒疫苗、核酸疫苗、载体疫苗、亚单位疫苗、病毒样颗粒疫苗和合成肽疫苗7大类。

Bac-to-Bac杆状病毒表达系统是一种常见的外源基因表达体系，其特点是高效、迅速、易于操作能够在大肠杆菌内快速构建重组病毒[22]。本研究根据所要表达ZIKV E蛋白的基因和结构特性以pFastBac1为供体质粒构建转移载体转化DH10Bac大肠杆菌，得到重组质粒rBacmid-E，转染sf9细胞，获得重组杆状病毒rBac-E，并进行了ZIKV E蛋白的表达和鉴定，为进一步研究ZIKV E蛋白的功能及ZIKV疫苗的研制奠定了基础。

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