李剑萍 潘能浪 谢志伟 杨可立 关玉娟 唐小平

510060 广州市第八人民医院肝病科

丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus, HCV)感染引起的丙型肝炎仍是严重危害人民健康的重要疾病。据世界卫生组织统计，全球丙型肝炎病毒感染率约为3%，估计有1.7亿人感染HCV。HCV感染后55%～85%的患者发展为慢性感染；在HCV感染后20年，一般人群肝硬化发生率为5%～15%[1]；一旦发展为失代偿期肝硬化，10年的生存率仅为25%[2]。直接抗病毒(Direct-acting antiviral，DAA)药物已在国外广泛应用，并取得了很好的抗丙肝病毒疗效，但目前国内小分子药物尚未上市，聚乙二醇干扰素联合利巴韦林治疗仍是目前国内的抗丙型肝炎病毒感染的标准疗法；在目前的标准治疗方案下，丙型肝炎1/4基因型患者的SVR率为40%～54%，而2/3基因型患者可获得65%～82%的SVR[3-4]，文献报道其治疗效果受宿主及病毒因素影响，如患者的年龄、体重、感染时间、HCV RNA水平、HCV基因型及IL28B基因多态性[5-6]。并且研究发现miR-122表达水平[7]、IL28B基因多态性和HCV准种[8]与个体干扰素疗效密切相关。

MicroRNA (miRNA) 是一类由内源基因编码的长度为 22 个核苷酸的非编码单链 RNA 分子， 它们在动植物中参与转录后基因表达调控。 miR-122 是在肝脏特异高表达的一种 microRNA，占肝脏 miRNAs70%，在整个肝脏发育过程中有着非常重要的调节作用[9-10]。miR-122 是目前通过实验确认的第一个与 HCV 复制有关的microRNA[11]。国内李苏娟[12]研究表明在细胞感染模型中 miR-122 不但促进 HCV 的复制， 而且 miR-122 的表达可部分中和 IFN-a 的抗 HCV 效应。 而静默 miR-122 的表达可通过调节 SOCS3(Suppressor of cytokine signaling，细胞因子信号转导负调控蛋白 3) 的启动子的甲基化而达到增强 IFN-a 抗病毒的作用[13]。同时研究表明 miRNA 的表达水平与 HBV 感染有密切关系[14]。 其中 HBV 感染患者的肝脏miR-122 的表达明显低于健康对照者， miR-122 水平与肝内病毒载量及肝脏炎症程度呈负相关， 而通过抑制内源性的 miR-122 可增强 HBV 复制[15]。因此，从目前的研究可以看出， miRNA-122 与丙肝病毒及乙肝病毒的复制密切相关，其表达水平可能与抗病毒疗效有关。 目前 miR-122 与 慢性丙型肝炎(Chronic hepatitis C，CHC)干扰素抗病毒疗效关系的体外研究较多，但国内相关临床研究报道较少。本课题旨在研究广东地区的慢丙肝患者肝组织和血清中 miR-122 的表达水平与慢丙肝临床治疗的相关性， 探讨是否可将miR-122 作为干扰素疗效的预测指标。

1 对象与方法

1.1对象按照2004 年中华医学会传染病和寄生虫病学分会与肝病学分会于联合制定的《丙型肝炎防治指南》标准，筛选来自广州市第八人民医院的基因 1 型 CHC 患者40例为研究对象，除外其他病毒重叠感染、酒精性肝病、自身免疫性肝病等，均无聚乙二醇干扰素α联合利巴韦林治疗的禁忌症，其中男性24例(60%)，女性16例(40%)，平均年龄(43.83±13.24)岁。

1.2方法

1.2.1 治疗方法：采用聚乙二醇干扰素α-2 a(PEG-IFN α-2 a) 180 μg或135 μg(上海罗氏制药有限公司 规格 180 μg/支和135 μg/支)或聚乙二醇干扰素α-2b (PEG-IFN α-2b)80 μg或50 μg(默沙东(中国)有限公司 规格 80 μg/支和50 μg/支)，皮下注射，每周1次，疗程48周。利巴韦林(ribavirin) 800～1 200 mg (广东华南药业有限公司 规格0.1 g/片),每d分次口服，疗程48周。

1.2.2 观察指标:治疗过程中对生化及病毒学指标进行检测。生化指标采用美国贝克曼公司全自动生化分析仪检测病毒学指标：采用PCR微板核酸杂交酶联免疫法检测HCV基因型(试剂盒购自广州蓝星生物科技开发公司)，HCV RNA定量检测采用罗氏诊断产品(上海)有限公司COBAS Taq man 定量检测试剂盒。HCV RNA<15IU/ml为阴性。miR-122：采用荧光定量PCR法检测血清miR-122(引物为广州锐博公司设计)；IL28B基因型：采用聚合酶链-连接酶检测反应进行分型(试剂盒购自广东东盛生物有限公司)(检测时间点：治疗前、治疗4周、12周、24周、36周、48周及治疗结束后24周)。

1.2.3 疗效评价:根据PEG-IFN α联合利巴韦林治疗结束后随访24周HCV RNA是否小于15IU/ml，分为持续病毒学应答组(sustained virological response，SVR)和非持续病毒学应答组(non sustained virological response，NSVR)。

1.3统计学方法所有数据采用SPSS 13.0统计软件进行统计分析，检测结果采用均数与标准差表示，计量资料采用t检测，计数资料采用χ2检验；线性回归用来评估变量之间的相关性。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1聚乙二醇干扰素α联合利巴韦林治疗CHC患者疗效本研究治疗结束后随访24周时有29例(72.50%)患者出现SVR，11例(27.5%)为NSVR。

2.2SVR组与NSVR组基线指标比较SVR组患者与NSVR组患者比较，基线HCV RNA载量、总胆红素 (Total bilirubin,TBIL) 水平、甲胎蛋白 (Alpha fetoprotein, AFP) 水平、肝脏硬度值(Fibroscan)、层粘连蛋白水平均更低，差异有统计学意义(P<0.05)，IL28B基因型有差异(P<0.05)；NSVR组基线血清miR-122水平为SVR组的3倍，但差异无统计学意义(P>0.05)；两组患者年龄、BMI、性别等无明显差异，见表1。

表1 两组患者的基线特征Tab.1 Baseline Characteristics of two groups of patients

注：合并疾病采用的均为四格表资料的Fisher确切概率法

Note：Data of the combined diseases were all analyzed with exact probability methods of 2 by 2 tables

2.3基线血清miR-122水平与慢性丙型肝炎聚乙二醇干扰素α治疗应答的关系SVR组和NSVR组基线miR-122水平分别为0.086±0.184和0.223±0.355，差异无统计学意义(P=0.246)，见图1。

图1 基线血清miR-122水平与慢性丙型肝炎聚乙二醇干扰素α治疗应答的关系Fig.1 The relationship between baseline MiR-122 level and response of patients with chronic hepatitis C treated with peg-interferon α

2.4SVR组与NSVR组患者miR-122最后一次测量值与基线值之间的差值比较两组患者最后一次miR-122水平测量时间为治疗结束后随访24周时。miR-122差值定义为最后一次测量值与基线值之间的差值。SVR组患者miR-122差值为0.044±0.239，NSVR组患者miR-122差值为0.215±0.355，两组患者miR-122差值比较差异无统计学意义(t=1.481,P=0.161)，见图2。

图2 SVR组与NSVR组患者miR-122最后一次测量值与基线值之间的差值比较Fig.2 The change of MiR-122 level from baseline to the last available measurement between SVR group and NSVR group

2.5慢性丙型肝炎患者基线血清miR-122水平与病毒学、生化、纤维化指标的关系慢丙肝患者基线血清miR-122水平与基线HCV RNA载量、ALT水平、AST水平、TBIL水平、AFP水平、凝血酶原时间、层粘连蛋白水平、透明质酸水平，Ⅲ型前胶原肽水平、IV型胶原水平、肝脏硬度值之间无相关性(P>0.05)，见表2。

表2 基线血清miR-122 线性回归分析Tab.2 Baseline miR-122 level linear regression analysis

3 讨论

CHC是终末期肝病的主要病因，CHC一旦进展为肝硬化，那么疾病可能会进入“加速”阶段，此时若不进行规范、有效的抗病毒治疗，则疾病很快将进展为失代偿阶段，发生肝细胞癌的比例也将提高；目前有许多研究发现患者年龄、体重、感染时程，HCV RNA载量、HCV基因型、IL28B多态性等宿主、病毒因素均可影响抗病毒疗效。

MicroRNA是一类约为22个碱基的小分子非编码RNA，主要与靶基因Mrna 3′非编码区部分互补，促进靶基因mRNA降解或抑制其翻译过程而发挥负调控作用[16]。

MicroRNA-122(miR-122)是含有22个碱基的肝脏特异性miRNA[17]，并且是肝脏中表达最丰富的miRNA[18]。miR-122的主要生理功能是调节脂质和胆固醇的代谢。Jopling等[19]体外研究发现发现HCV病毒的复制依赖于miR-122的表达状态，只有在表达miR-122的Huh 7细胞中HCV才能复制；研究亦发现[20-21]，在慢性丙型肝炎及丙肝相关性肝硬化、肝癌患者血清中miR-122水平是显著高于HCV阴性的人群，且血清miR-122与ALT水平、呈正相关，并提出miR-122可作为丙肝相关性肝癌诊断的一个标志物。Su等[22]报道，①血清miR-122与血浆(r=0.943)及肝脏(r=0.51)miR-122存在相关性，②基线血清miR-122肝脏组织活动指数(hepatic histology activity index，HAI) 评分及血清ALT存在正相关，但与HCV病毒载量、肝脏纤维化及血脂无相关性，③获得完全早期应答(complete early virologic response, cEVR) 或SVR患者较NR患者有更高的基线miR-122水平。在本研究中，我们发现NSVR组基线血清miR-122水平较SVR组高3倍，这也验证了miR-122的存在可以促进HCV的复制，但两组血清miR-122水平差异无统计学意义，考虑①本研究测得miR-122值为非正态分布，个别值离散程度大，②研究病例数较少；我们亦未发现血清miR-122与HCV RNA载量存在相关性，与既往报道相符；而在整个研究中，本研究亦未发现血清miR-122与其他指标存在相关性，考虑为本研究纳入病例数少，且miR-122值为非正态分布，个别值离散程度大。

本研究旨在分析血清miR-122与SVR的关系，并且比较SVR与NSVR基线病毒指标、生化指标等的差异。在本研究中发现，SVR组与NSVR组比较，基线HCV RNA载量、AFP及Fibrosacn均较低，这与Mabrouk等[23]报道的一致。Safarnezhad等[6]发现在SVR组患者中IL28B CC基因型占90.9%，随之是CT基因型(54%)及TT基因型(25%)，Ge 等[24]亦发现不管是在European-Americans、African-Americans 还是Hispanics，IL28B rs12979860 与SVR强烈相关，进一步研究发现主要是IL28B rs12979860 CC基因型与SVR相关。在研究中我们亦发现SVR组患者中IL28B 基因型主要为CC基因型(占93.10%)，而SVR组CC基因型占54.55%。本研究中SVR组较NSVR组基线总胆红素水平低，总胆红素水平反映肝脏代谢功能，有研究发现基线高总胆红素水平预示肝功能失代偿，肝功能失代偿会降低抗病毒治疗的效果甚至增加治疗的风险。层粘连蛋白作为肝纤维化指标，其升高提示肝纤维化倾向，在本研究中也发现基线层粘连蛋白水平高的患者不易获得SVR。既往研究也发现年龄、性别、ALT、AST等与应答相关，但在本研究中未发现上述因素与应答相关，考虑与本研究的病例数较少有关。

综上所述，HCV RNA载量、IL28B基因型及肝脏纤维化程度均可应答聚乙二醇干扰素联合利巴韦林抗丙肝病毒疗效，血清miR-122可能对抗病毒疗效发挥关键作用。由于本研究样本例数较少，还需要通过增加样本数及进一步深入的生物学研究阐明其调控机制，从而有望发现miR-122在抗病毒治疗中发挥更大的作用。

[1] Freeman AJ, Dore GJ, Law MG, et al. Estimating progression to cirrhosis in chronic hepatitis C virus infection[J]. Hepatology, 2001,34(4 Pt 1):809-816. doi: 10.1053/jhep.2001.27831.

[2] Huang YW, Yang SS, Fu SC, et al. Increased risk of cirrhosis and its decompensation in chronic hepatitis C patients with new-onset diabetes: a nationwide cohort study[J]. Hepatology, 2014,60(3):807-814. doi: 10.1002/hep.27212.

[3] 徐严, 斯庆图娜拉, 郎轶宣, 等. 聚乙二醇干扰素α-2a个体化抗病毒治疗慢性丙型肝炎的疗效[J].中华传染病杂志,2012,30(3):165-169.doi: 10.3760/cma.j.issn. 1000-6680.2012.03.009.

[4] Rumi MG, Aghemo A, Prati GM, et al. Randomized study of peginterferon-alpha2a plus ribavirin vs peginterferon-alpha2b plus ribavirin in chronic hepatitis C[J]. Gastroenterology, 2010,138(1):108-115.doi: 10.1053/j.gastro.2009.08.071.

[5] 李剑萍, 关玉娟, 洪文昕, 等. 聚乙二醇干扰素联合利巴韦林治疗慢性丙型肝炎患者疗效及其影响因素分析[J].实用肝脏病杂志,2014,17(2):149-153.doi: 10.3969/j.issn.1672-5069.2014.02.010.

[6] Safarnezhad TF, Karbalaie NMH, Sohrabi M, et al. Polymorphism of IL-28B Gene (rs12979860) in HCV Genotype 1Patients Treated by Pegylated Interferon and Ribavirin[J]. Iran J Pathol, 2016,11(3):216-221.

[7] El-Ahwany E, Nagy F, Zoheiry M, et al. The Role of MicroRNAs in Response to Interferon Treatment of Chronic Hepatitis C patients[J]. Electron Physician, 2016,8(2):1994-2000. doi: 10.19082/1994.

[8] Zhang L, Han F, Zhang D, et al. Mutations in different regions of the genome of hepatitis C virus genotype 1b and association with response to interferon therapy[J]. Int J Mol Med, 2012,30(6):1438-1442. doi: 10.3892/ijmm.2012.1155.

[9] Fukuhara T, Matsuura Y. Role of miR-122 and lipid metabolism in HCV infection[J]. J Gastroenterol, 2013,48(2):169-176. doi: 10.1007/s00535-012-0661-5.

[10] Esau C, Davis S, Murray SF, et al. miR-122 regulation of lipid metabolism revealed by in vivo antisense targeting[J]. Cell Metab, 2006,3(2):87-98. doi: 10.1016/j.cmet.2006.01.005.

[11] Jopling CL, Schütz S, Sarnow P. Position-dependent function for a tandem microRNA miR-122-binding site located in the hepatitis C virus RNA genome[J]. Cell Host Microbe, 2008,4(1):77-85. doi: 10.1016/j.chom.2008.05.013.

[12] 李苏娟, 陈智, 朱海红. miR-122对IFN-α抗HCV效应的影响[J].浙江大学学报(医学版),2011,40(6): 588-592. doi:10.3785/j.issn.1008-9292.2011.06.003.

[13] Yoshikawa T, Takata A, Otsuka M, et al. Silencing of microRNA-122 enhances interferon-α signaling in the liver through regulating SOCS3 promoter methylation[J].Sci Rep,2012,2:637. doi: 10.1038/srep00637.

[14] 陈霖, 李沛然, 黄雨欣,等. 慢性乙型肝炎microRNA诊断标志物及其与乙型肝炎病毒复制相关性研究[J]. 中华实验和临床病毒学杂志, 2016, 30(5):417-420.doi：10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.05.001.

[15] Wang S, Qiu L, Yan X, et al. Loss of microRNA 122 expression in patients with hepatitis B enhances hepatitis B virus replication through cyclin G(1) -modulated P53 activity[J]. Hepatology, 2012,55(3):730-741. doi: 10.1002/hep.24809.

[16] Guo H, Ingolia NT, Weissman JS, et al. Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels[J].Nature,2010,466(7308):835-840.doi: 10.1038/nature 09267.

[17] Lagos-Quintana M, Rauhut R, Yalcin A, et al. Identification of tissue-specific microRNAs from mouse[J]. Curr Biol, 2002,12(9):735-739.

[18] Chang J, Nicolas E, Marks D, et al. miR-122, a mammalian liver-specific microRNA, is processed from hcr mRNA and may downregulate the high affinity cationic amino acid transporter CAT-1[J]. RNA Biol, 2004,1(2):106-113.

[19] Jopling CL, Yi M, Lancaster AM, et al. Modulation of hepatitis C virus RNA abundance by a liver-specific MicroRNA[J]. Science, 2005,309(5740):1577-1581.doi: 10.1126/science. 1113329.

[20] Dubin PH, Yuan H, Devine RK, et al. Micro-RNA-122 levels in acute liver failure and chronic hepatitis C[J]. J Med Virol, 2014,86(9):1507-1514.doi: 10.1002/jmv.23987.

[21] ATA Elmouttaleb, DM Abdelatif, GM Soliman,et al. Serum Micro RNA-122 as a Biomarker for Hepatocellular Carcinma in Chronic Hepatitis C Virus Patients[J]. ResCancer Tumor, 2015, 4(2): 25-33.doi: 10.5923/j.rct.20150402.01.

[22] Su TH, Liu CH, Liu CJ, et al. Serum microRNA-122 level correlates with virologic responses to pegylated interferon therapy in chronic hepatitis C[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2013,110(19):7844-7849. doi: 10.1073/pnas.1306138110.

[23] Mabrouk M, Salama R, Gamal H，et al. Baseline Predictors of Sustained Virological Response to Pegylated Interferon and Ribavirin in Egyptian Patients Infected with Viral Hepatitis C [J]. Med J Cairo Univ, 2013, 80(2): 519-523.

[24] Ge D, Fellay J, Thompson AJ, et al. Genetic variation in IL28B predicts hepatitis C treatment-induced viral clearance[J]. Nature, 2009,461(7262):399-401.doi: 10.1038/nature08309.