付春鹏

(山东省潍坊科技学院 262700)

基因是生命遗传的基本单位。由数以亿计的碱基对组成的基因组，蕴藏了生命体遗传信息的奥秘。对核酸序列进行测序是正确解读这部“天书”的基础，也是最为关键的一步。迄今，测序技术共经历了四代变革。20 世纪 70 年代出现了第一代经典的Sanger测序技术，人类基因组计划的实施推动了边合成边测序的第二代测序技术的诞生及发展，近几年分别以单分子和纳米孔测序为标志的第三和第四代测序技术应运而生。其中第二、第三和第四代测序技术统称为下一代测序(next generation sequencing，NGS)技术。本文概述了这些测序技术的基本原理及特点。

1 第一代测序技术

早在1954年，Whitfeld就已经报道使用层析法测定了多聚核糖核苷酸的序列。第一代测序技术的标志是Sanger 于1977 年发明的 DNA 双脱氧核苷酸末端终止测序法，以及Maxam和Gilbert 于同年发明的DNA化学降解测序法[1]。其中，Sanger法的核心原理是：由于ddNTP的2′和3′都不含羟基，在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA合成反应。在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP(分别为：ddATP、ddCTP、ddGTP和ddTTP)，通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列[2]。Sanger 测序技术操作快速、简单，因此被广泛应用。20世纪80年代末，荧光标记技术凭借着更加安全简便的特性，逐步取代同位素标记技术，由此也诞生了自动化测序技术。由于可以用不同荧光标记4种ddNTP，使得最后产物的电泳分离过程可以在一个泳道内实现，用激光对ddNTP上的荧光标记进行激发，然后检测不同波长的信号，通过计算机处理信号后即可获得碱基序列，很好地解决了原技术中不同泳道迁移率存在差异的问题。……