王兴玲，于明新

苦参碱联合胸腺五肽对卵巢癌腹腔热化疗大鼠免疫功能的影响

王兴玲，于明新*

目的 探讨苦参碱联合胸腺五肽对经腹腔热化疗治疗的卵巢癌大鼠免疫功能的影响。方法 将46只成功造模的卵巢癌大鼠随机分为对照组和观察组，每组23只，两组大鼠均进行腹腔热化疗(顺铂)并同时给予胸腺五肽，观察组大鼠在此基础上给予苦参碱，共进行3周。比较两组大鼠治疗前后腹围、体重、免疫功能、血清CA125水平变化情况。结果 治疗后，两组大鼠体重、腹围增加(P<0.05)，观察组大鼠体重、腹围低于对照组(P<0.05)。治疗后，两组血清CD3、CD4、自然杀伤细胞(NK)、IgG、IgM、IgA浓度与CD4/CD8较治疗前降低(P<0.05)，CD8较治疗前升高(P<0.05)；观察组患者血清CD3、CD4、CD4/CD8、IgG、IgM、IgA浓度明显高于对照组(P<0.05)，CD8较对照组降低(P<0.05)。治疗后，两组大鼠IL-2、IL-4浓度降低(P<0.05)，且观察组IL-2、IL-4浓度明显高于对照组(P<0.05)；两组IL-6、IL-12浓度较治疗前升高(P<0.05)，且观察组IL-6、IL-12浓度明显低于对照组(P<0.05)；两组大鼠CA125水平均较治疗前降低(P<0.05)，且观察组低于对照组(P<0.05)。结论 对行腹腔热化疗的卵巢癌大鼠给予苦参碱联合胸腺五肽，有助于改善卵巢癌大鼠的免疫功能与一般状态。

卵巢癌；苦参碱；胸腺五肽；腹腔热化疗；免疫功能；CA125

0 引言

卵巢癌早期临床症状不明显，一般到晚期才出现临床症状，因此其早期诊断困难，而晚期卵巢癌死亡率高居妇科恶性肿瘤之首。临床常采取综合疗法(手术结合放化疗)治疗卵巢癌，但是此方法控制肿瘤复发及转移的效果仍然较差，因此需要探寻一种新的治疗方案[1]。腹腔热化疗(Intraperitoneal hyperthermic chemotherapy，IPHC)作为近年来新出现的配合手术治疗腹腔恶性肿瘤及其转移瘤的综合化疗方案，目前在临床实践中广泛使用[2-4]，卵巢癌腹腔内发生浸润转移率较高，针对其热敏感这一特点，我们选择了IPHC进行研究[5-6]。

苦参碱是由苦参中提取的一种具有抗肿瘤活性的物质，通过激活肿瘤凋亡基因的表达与提高自身抗肿瘤免疫活力来发挥抗肿瘤作用[7]。胸腺五肽是临床中常用的肿瘤辅助化疗药物，能提高机体自身免疫力，在临床上得到了广泛应用[8]。我们通过建立大鼠卵巢癌实验动物模型来研究IPHC的疗效及辅助性的苦参碱与胸腺五肽的免疫调节作用，现总结如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 实验动物与卵巢癌细胞株的选择 选用58只近交系健康雌性Fischer344大鼠(北京维通利华实验动物科技有限公司)，周龄8～10周，体重120～150 g；NuTu19卵巢癌细胞株(上海纪宁生物科研有限公司)。选取造模成功的大鼠46只，按照随机数字表法分为观察组与对照组，每组23只。大鼠每4只一笼饲养，普通颗粒饲料喂养，自由饮水取食，人工控温20～26 ℃，12 h光照，12 h黑暗，治疗中共死亡5只(对照组2只，观察组3只)，完成实验的大鼠共41只(对照组21只，观察组20只)。两组大鼠的周龄、体重等方面比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 两组大鼠治疗前基本情况分析

1.1.2 主要试剂 苦参碱(粉末，纯度>99%)由美国Sigma公司提供；胸腺五肽由深圳翰宇药业股份有限公司提供(5 mg/支，白色粉末状)；顺铂(20 mg/支，白色粉末状)由齐鲁制药有限公司提供；酶联免疫法检测试剂盒(IL-2、IL-4、IL-6、IL-12)由美国Sigma公司提供；淋巴细胞分离液(Ficoll-hypque)由美国Sigma公司提供；IgGrl-FITC/IgGr2a-PE、CD3-FITC/CD4-PE、CD3-FITC/CD8-PE和FACS Lysing Solution溶血素为BD公司产品；IgG、IgM、IgA体液免疫指标检测采用美国BD公司提供的双色荧光试剂盒；RPMI-1640培养液由美国Gibco公司提供。

1.1.3 主要仪器 Model2300 CO2培养箱(美国Sheldon公司提供)；AxSYM型全自动免疫发光分度仪与FACSCalibur流式细胞仪(美国雅培公司提供)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养方案 将NuTu-19细胞接种于RPMI-1640培养液(含10%小牛血清)中，并置于37 ℃的CO2培养箱中。

1.2.2 建立Fischer344大鼠上皮性卵巢癌动物模型[6]用胰酶消化所培养出来的对数生长期NuTu-19细胞并调整细胞计数，将细胞(5×106/只)注射入大鼠腹腔中，然后SPF条件饲养，每周测1次体重与腹围，观察动物生长情况(体重增长与腹围变化)，记录一般状态(毛发情况、行动速度、反应速度、饮食情况)，饲养3周后进行分组治疗处理(采用随机数字表法随机分为观察组与对照组)。

1.2.3 腹腔热化疗治疗方案 根据NuTu-19细胞的生物学特征[9]及其体外细胞药敏实验证实对顺铂敏感性高[半抑制浓度(IC50)=0.83 μg/mL]，因此，可用生理盐水将腹腔顺铂注射液浓度调整为0.83 μg/mL。两组大鼠每日给予腹腔注射辅助性的免疫增强剂[胸腺五肽1 mg/(kg·d)]、20 mL顺铂(0.83 μg/mL)一次性腹腔灌注(每周三进行，每周1次)，灌注液利用电热恒温水浴箱一次性加热，使药液进入腹腔时温度维持在43 ℃，连续进行以上给药方案3周。观察组在对照组的基础上给予苦参碱注射液腹腔注射[3 mg/(kg·d)]。苦参碱、胸腺五肽均溶解于0.9%生理盐水中(1 mg/mL)配成混悬液，现用现配。

1.2.4 免疫指标的测定 化疗前后抽取静脉血3 mL，注入玻璃试管中，静置10 min，以3 000 r/min离心10 min，分离血清在-70 ℃超低温冰箱内保存待测，采用流式细胞仪、细胞计数仪检测外周血T细胞亚群(CD3、CD4、CD8)水平，用淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离外周血有核细胞，外周血中有核细胞染色标记30 min，弃上清液，冲洗2次后上机检测。免疫散射比浊法检测免疫球蛋白(IgG、IgM、IgA)；酶联免疫法测定血清中IL-2、IL-4、IL-6、IL-12(检测时按试剂盒说明进行)，所取标本均在1周内测定。

1.2.5 外周血清CA125的检测 抽取尾缘静脉血2 mL，将血清离心(1 000 r/min)20 min后抽取上清液置于试管中，利用电化学发光免疫分析法测定血清CA125水平(具体步骤依据试剂盒说明进行)。

2 结果

2.1 大鼠造模情况及一般状态 58只大鼠成功造模46只，失败12只，其中造模过程中死亡6只(50.00%)、造模后出现严重腹水导致恶病质4只(33.33%)、造模未达到实验所需的卵巢癌模型2只(16.67%)。造模过程中大鼠均出现不同程度的腹围增加、食欲减退、毛色暗淡、反应力降低，将造模成功的大鼠随机分为观察组与对照组，每组23只，治疗中共死亡5只(对照组2只，观察组3只)，治疗过程中两组死亡率比较差异无统计学意义(χ2=0.224，P=0.636)，41只大鼠完成试验(对照组21只，观察组20只)。

2.2 大鼠治疗前后体重、腹围变化情况比较 大鼠治疗后处死，解剖腹部，肉眼观察见两组大鼠腹腔内均有大量腹水，大网膜增厚并粘连，腹膜、肠管等处均有直径约1～3mm粟粒状结节，两组均未发现肝、肺转移。观察组大鼠腹水多于对照组，且发生肠粘连严重程度较对照组高。两组大鼠治疗后体重、腹围均高于治疗前(P<0.05)，但观察组低于对照组(P<0.05)。见表2。

表2 两组大鼠治疗前后体重、腹围情况比较

注：*与对照组比较，P<0.05

2.3 两组大鼠治疗前后免疫指标比较 治疗后，两组大鼠血清CD3、CD4、自然杀伤细胞(NK)、IgG、IgM、IgA浓度与CD4/CD8降低(P<0.05)，CD8升高(P<0.05)；观察组大鼠血清CD3、CD4、CD4/CD8、IgG、IgM、IgA浓度明显高于对照组(P<0.05)，CD8低于对照组(P<0.05)。治疗后两组大鼠IL-2、IL-4浓度降低(P<0.05)，且观察组高于对照组(P<0.05)；治疗后两组大鼠IL-6、IL-12浓度较治疗前升高(P<0.05)，且观察组低于对照组(P<0.05)，结果见表3～表5。

2.4 两组大鼠治疗前后血清CA125水平比较 治疗后两组大鼠CA125水平降低(P<0.05)，且观察组低于对照组(P<0.05)。见表6。

3 讨论

约90%的卵巢恶性肿瘤来源于上皮细胞，早期临床症状不明显，发现时已进入晚期，因此腹腔转移率高，5年生存率(约30%)较低。肿瘤的分化程度、病理类型是影响其恶性程度的重要原因[10]。近年来IPHC受到了国内外学者的广泛关注，Ⅱ期以上卵巢癌行减瘤术后常用该方法。盆腔种植转移与播散是卵巢癌的主要转移途径，因早期不易被发现，故就诊时已经发生腹腔内广泛转移，给手术带来了较大困难，且对患者创伤较大。IPHC在治疗术后复发患者中有着较好的临床疗效[11]。顺铂临床效果较好，但其不良反应(骨髓抑制、胃肠反应为主)较多，临床使用受到限制[12]。苦参碱是从苦参的干燥根中提取的一类具有抗肿瘤作用的生物活性物质，研究显示，苦参碱具有多种抗肿瘤活性，主要通过诱导肿瘤细胞分化凋亡来达到抗肿瘤目的。此外，还能通过抑制肿瘤新生血管的形成来抑制肿瘤的浸润与远处转移，有一定的止痛效果，在降低其他化疗药物不良反应的同时，能增强机体自身免疫功能，临床上常常用于肿瘤的预防性化疗[13]。胸腺五肽是人工合成的免疫调节剂，是胸腺生成素Ⅱ第32～36位的氨基酸片段，具有胸腺生成素活性，通过诱导T淋巴细胞分化来促进并激活淋巴细胞的活性，调节T淋巴细胞亚群的分化比例，达到正常比例[14]。

表3 两组大鼠治疗前后细胞免疫功能比较

注：*与对照组比较，P<0.05

表4 两组大鼠治疗前后体液免疫功能比较(g/L)

注：*与对照组比较，P<0.05

表5 两组大鼠治疗前后免疫相关细胞因子水平比较

注：*与对照组比较，P<0.05

表6 两组大鼠治疗前后外周血CA125水平比较

注：*与对照组比较，P<0.05

机体的T淋巴细胞(包括CD3、CD4、CD8亚群等)主要负责机体的特异性免疫应答，而恶性肿瘤患者由于肿瘤细胞浸润与化疗手术的创伤造成其免疫功能低下，外周血清表现为淋巴细胞与白细胞浓度降低。临床研究证实，恶性肿瘤患者外周血清T淋巴细胞亚群(CD3、CD4、CD8)浓度降低[15]。B淋巴细胞通过分泌抗体(IgG、IgM、IgA)来发挥机体非特异免疫应答，其免疫应答强弱主要体现为浓度的高低[16]。本研究表明，化疗后，两组大鼠的细胞免疫与体液免疫均降低，对观察组大鼠给予苦参碱，能很好地提高大鼠的免疫(细胞、体液免疫)功能，且T淋巴细胞各个亚群对应的细胞因子也发生相应的升高与降低，进一步证实化疗对大鼠机体细胞免疫与体液免疫功能均有一定损伤，从而导致相关细胞因子降低，而苦参碱能明显改善其免疫功能降低。CA125在临床中广泛用于卵巢癌治疗后的临床疗效评价[17]。本研究结果表明，治疗后，两组大鼠CA125水平均降低，且观察组低于对照组。而观察组大鼠腹水少于对照组，且发生肠粘连严重程度低于对照组，与尹艳英[5]所得结果相同。此外，治疗后两组大鼠体重、腹围均增加，且观察组高于对照组，说明卵巢癌大鼠腹水增加，而免疫调节剂能延缓腹水增加，化疗药物能抑制瘤体增生，进一步证实苦参碱与胸腺五肽具有良好的调节免疫与改善卵巢癌大鼠一般状态的功能，是很好的化疗辅助性用药。

本研究通过建立大鼠卵巢癌动物模型来证实卵巢癌腹腔热化疗的重要性，并采用苦参碱与胸腺五肽两种免疫调节剂辅助腹腔热化疗，证实了其有较好的免疫调节能力，能够弥补化疗药物对自身免疫功能的损伤，同时还有一定的抑制肿瘤生长的作用。此外，机体营养状态也直接影响了抗肿瘤免疫力，今后我们将进一步研究免疫调节剂与营养状态的关系，以更好地指导临床实践。

[1] 邢堃,孔为民.卵巢癌放疗的现状和进展[J].现代妇产科进展,2015,24(1):69-71.

[2] 吴印兵,潘明新,崔书中,等.B超引导下持续循环腹腔热灌注化疗治疗恶性腹水的临床应用初探[J].实用医学杂志,2016,32(3):440-443.

[3] 刘方丽,梁军,侯锦乡,等.国产紫杉醇联合体外高频热疗治疗恶性腹腔积液的效果观察[J].中国医药,2014,9(2):207-210.

[4] 陈祖龙,吴印兵,唐鸿生,等.腹腔热灌注化疗联合静脉化疗治疗恶性腹水的临床疗效观察[J].实用医学杂志,2014,30(18):2950-2952.

[5] 尹艳英.腹腔热化疗对大鼠卵巢癌血清CA125表达水平影响的研究[J].齐齐哈尔医学院学报,2010,31(22):3529-3532.

[6] Yoshida Y,Sasaki H.Efficacy of intraperitoneal continuous hyperthermic chemotherapy as consolidation therapy in patients with advanced epithelial ovarian cancer:a long-term follow-up[ J].Oncol Rep,2005,13(1):121-125.

[7] 毛玲,薛天阳,许伟.苦参碱对人肾母细胞瘤SK-NEP-1细胞趋化因子受体4表达的影响[J].临床儿科杂志,2014,32(5):467-470.

[8] 李刚.胸腺五肽对胃癌化疗患者CD4+CD25+Treg细胞的影响及临床意义[J].中国社区医师,2011,13(13):244-245.

[9] Gurkan ZC,Eylem SAP.Hyperthermia in gynecologic cancers[J].Eur J Gynaecol Oncol,2003,24(3-4):282-286.

[10]Conti M,DeGiorgi U.Clinical pharmacology of intraperitonealcisplatin-based chemotherapy[J].Chemotherapy,2004,16(5):23-25.

[11] Hildebrandt B,Wust P,Ahlers O,et al.The cellular and mo-lecular basis of hyperthermia[J].Crit Rev Oncol Hematol,2002,43(1):33-56.

[12] 池丽芬,李民驹.顺铂腹腔热灌注化疗与其他用药方式药代动力学比较[J].实用肿瘤杂志,2000,15(3):179-182.

[13]王云,龙发.苦参抗肿瘤机制的研究进展[J].现代肿瘤医学,2015,23(2):280-282.

[14]赵春玲.胸腺五肽配合化疗治疗中晚期恶性肿瘤疗效观察[J].中国营养保健,2013,23(4):612.

[15]Jemal A,Bray F,Center MM,et al.Global cancer statistics[J].CA Cancer J Clin,2011,62(2):69-90.

[16]李晓辉,李军民,冯秋霞,等.围手术期肠内营养支持对食管癌患者术后免疫功能的影响[J].中国医学创新,2011,8(8):57-59.

[17]Rustin G,Nelostrop AE,Bentzen SM,et al.Selection of active drugs for ovarian cancer based on CA-125 and standard response rates in phase Ⅱ trials[J].J Clin Oncol,2000,18(8):1733-1739.

Effects of matrine combined with thymopeptide-5 on immune function of rats with ovarian carcinoma treated by intraperitoneal hyperthermic chemotherapy

WANG Xing-ling,YU Ming-xin*

(Cancer Hospital of China Medical University,Liaoning Cancer Hospital & Institute,Shenyang 110042,China)

Objective To study the effects of matrine combined with thymopeptide-5 on immune function of rats with ovarian carcinoma treated by intraperitoneal hyperthermic chemotherapy.Methods Totally 46 rats which were successfully modelled asovarian carcinoma were randomly divided into two groups:observation group (n=23) and control group (n=23).All the rats were given intraperitoneal hyperthermic chemotherapy (cis-platinum) and thymopeptide-5,and the rats in observation group were added with matrine,the course of treatment lasted for 3 weeks.The waist circumference,weight,index of immune function,and the level of CA125 in the two groups were compared before and after treatment.Results After treatment, the waist circumference and weight of rats increased (P<0.05), and those in observation group were lower (P<0.05).After treatment, the levels of CD3, CD4, NK, IgG, IgM, IgA, IL-2, IL-4, CD4/CD8 and CA125 decreased significantly (P<0.05), while the levels of CD8, IL-12, and IL-6 increased (P<0.05), and there were significant differences in the above indexes between the two groups (P<0.05).Conclusion Matrine combined with thymopeptide-5 can improve the general state and the immune function in rats with ovarian carcinoma treated by intraperitoneal hyperthermic chemotherapy.

Ovarian carcinoma;Matrine;Thymopeptide-5;Intraperitoneal hyperthermic chemotherapy;Immune function;CA125

2016-06-12

中国医科大学肿瘤医院辽宁省肿瘤医院，沈阳 110042

辽宁省自然科学基金项目(2013225021)

10.14053/j.cnki.ppcr.201701002

*通信作者