侯俊杰，杨 影，李孝男，倪志强，周 颖，江显卓，谭 岩，方艳秋

(吉林省人民医院 医学诊治实验中心，吉林 长春130021)

异体CIK联合血浆置换干预晚期原发性肝癌的临床研究

侯俊杰，杨 影，李孝男，倪志强，周 颖，江显卓，谭 岩，方艳秋*

(吉林省人民医院 医学诊治实验中心，吉林 长春130021)

目的 研究异体CIK联合血浆置换临床治疗肝癌的效应和机制。方法 分离健康人外周血单个核细胞(PBMC)，加入细胞因子诱导成CIK细胞，体外培养扩增。病例均给予内科综合支持治疗情况下，随机分为异体CIK细胞治疗组和异体CIK+血浆置换治疗组。应用ELISA法比较二组治疗前后血浆中IFN-γ、IL-4、IL-10、TGF-β、VEGF的浓度变化；流式细胞术检测二组治疗前后患者外周血中CD3+和CD4+细胞比例、CD4+/CD8+比值、CD8+细胞比例；比较二组患者的生存质量、无进展生存期(PFS)、总生存期(OS)。结果 二组异体CIK的抗肿瘤免疫效应均上调，异体CIK+血浆置换治疗组免疫上调显著，与同时下调IL-4、IL-10和TGF-β、VEGF的血浆浓度有关(P<0.05)；流式细胞术检测发现，治疗后的患者外周血中CD3+、CD4+细胞比例和CD4+/CD8+比值明显上升，CD8+细胞比例下降，以异体CIK+血浆置换治疗组更为显著(P<0.05)；PFS长于单纯异体CIK细胞治疗组(P<0.05)，OS无延长(P>0.05)；生活质量显著优于异体CIK细胞治疗组(P<0.01)。结论 通过应用异体CIK细胞过继免疫治疗+血浆置换方案，可抑制和清除免疫抑制性细胞和免疫抑制因子，上调CIK细胞免疫效应及数量，可抑制原发性肝癌进展，改善患者生活质量。

CIK；肝癌；血浆置换；细胞因子

(ChinJLabDiagn,2017,21:0050)

肝癌是世界上第五大常见实质性恶性肿瘤和第三大癌症致死原因，每年超过60万人因疾病进展而死于该病[1]。目前传统的化学治疗和放射治疗效果不佳，手术是有效治疗的手段，然而只有小部分患者获益，靶向治疗单纯应用获益有限[2]，由于治疗手段有限，因此总体预后极差。

肝癌的生长、侵袭和转移与血液及肿瘤微环境中的细胞因子上调具有直接相关性，如IL-10、IL-4、TGF-β、VEGF等，实验证明，在肝癌患者的肿瘤细胞、血浆和尿液中可检测到上述因子的水平明显升高，由于体内血浆量最大，其内细胞因子水平最高[3]。肿瘤细胞可通过多种途径逃避机体免疫监视系统，包括肿瘤对T淋巴细胞的功能抑制，诱导分化出免疫抑制细胞如髓源性抑制细胞调节性T细胞等，同时肿瘤可导致免疫抑制因子如IL-10、IL-4、TGF-β、VEGF的上调等，诸多前临床实验已证明抑制或清除髓源性抑制细胞、调节性T细胞和免疫抑制因子等，同时提高CIK细胞免疫效应及数量，可提高CIK细胞抗肿瘤效应[4]。血浆置换(PE)技术已广泛应用于临床，它通过暂时替代肝脏的功能，分离血细胞和血浆，从而将血液中的免疫抑制因子、内毒素、胆红素等有害物质清除，改善机体内环境，在重症肝病的治疗中得到应用[5]。因此，通过输注异体CIK细胞联合血浆置换(PE)技术，清除血浆中的免疫抑制因子，同时提高CIK细胞免疫效应及数量，改变了肿瘤的微环境，有可能成为晚期肝癌免疫治疗的有效辅助手段，为临床治疗晚期原发性肝癌提供新策略。收集2014年5月-2015年5月间在本院就诊的60例原发性肝癌患者，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2014年5月-2015年5月间在本院就诊的60例原发性肝癌患者，符合2009 年发布的《原发性肝癌规范化诊治专家共识》的标准。年龄>18岁，肝功能为Child-Pugh B级或C级，预计生存期超过2个月；无生物制品过敏史，无严重细菌、病毒感染，非妊娠及哺乳期患者；自愿入组，患者或授权家属签署治疗知情同意书。

排除标准：出现肝性脑病、消化道出血等严重并发症，其他病毒感染，酒精性、药物性肝损伤，严重凝血机制障碍，合并心、肝、肾、造血及代谢系统严重原发性疾病或严重全身感染者。

在60例原发性肝癌患者中，男性56例，女性4例；年龄28-79岁，平均年龄(53.3±10.2)岁。按随机自愿原则，分为异体CIK治疗组(CIK group)30 例、异体CIK+血浆置换治疗组(CIK+ Plasma exchange group，CIK-PE)30例。二组临床特征均无统计学差异。

1.2 方法

1.2.1 CIK细胞的培养和治疗方法 采集健康人外周血单个核细胞，Ficoll淋巴细胞分离液梯度离心，收集白膜层的单个核细胞，以生理盐水洗涤3次后悬浮于RPMI 1640(Gibco公司，美国)中，5% CO2、37℃孵箱中放置2小时，调整非贴壁细胞密度为2×106/毫升，用含10%胎牛血清(EXCELL?公司，上海)的初始培养基在37℃、5% CO2条件下培养，并在培养基中添加 IFN-γ 1 000 U/ml 和rhIL-2 1 000 U/ml(均购自北京双鹭药业有限公司，北京)以及50 ng/ml抗人CD3单克隆抗体(T&L生物公司，北京)。每2 d按照细胞浓度添加新鲜培养基及rhIL-2(1 000 U/ml)，培养至7 d后收集细胞。收集的CIK细胞约1×109-1×1010/ml，细胞存活率在95%以上。在符合GLP标准的无菌实验室培养配制成CIK细胞悬液，采血后培养每天抽取培养上清，检测细菌、真菌、支原体、解脲及内毒素等，所有样本检测结果为阴性后回输，直至疾病进展。

1.2.2 血浆置换治疗方法 应用日产KURARAY-KM8800型血浆置换仪，股静脉常规消毒穿刺后，置入双腔导管并固定，建立血液通路，每次置换2 500-3 000 mL的同型血浆，每周1 次。

1.2.3 细胞因子检测 ELISA法检测两组治疗前后细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-1O、TGF-β及VEGF的浓度。

1.2.4 免疫功能检测 收集患者治疗前后外周血细胞，配成1×106个/ml的细胞悬液，接种于6孔板中，每孔2 ml，每组3复孔，按照说明书，加入相应的流式抗体，经流式细胞仪(FACS)检测CD3+细胞、CD4+细胞、CD4+/CD8+细胞和CD8+细胞比例，Cell Quest软件分析。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 治疗前后细胞因子水平的比较

在治疗前，两组患者的IFN-γ、IL-4、IL-10、TGF-β及VEGF水平差异无统计学意义(P>0.05)；在治疗2疗程后，两组患者的IFN-γ无明显下降，差异无统计学意义(P>0.05)；而IL-4、IL-10、TGF-β及VEGF水平均有不同程度的下降，其中联合治疗组患者的下降程度明显高于单纯异体CIK组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 治疗前后细胞因子水平的比较

注：*P<0.05 (治疗前 vs 治疗后)；#P<0.05 (CIK vs CIK-PE)

2.2 治疗前后免疫功能比较

治疗后两组患者CD3+和CD4+细胞比例和CD4+/CD8+比值明显上升，CD8+细胞比例下降，CIK治疗前后差异有统计学意义(P<0.05)；与单纯异体CIK治疗组比较，异体CIK联合血浆置换治疗更能改善患者的免疫功能，差异有统计学意义(P<0.05)，结果见表2。

2.3 生存期比较

联合治疗组肿瘤无进展生存期(PFS)长于单线异体CIK细胞治疗组，差异显著(P<0.05)；联合治疗组总生存期优于单纯异体CIK细胞治疗组，但两者差异不显著。见表3。组内比较，两组患者治疗后的KPS评分均显著高于治疗前(P<0.05)；组间比较，治疗前两组患者的KPS评分之间的差异均不显著(P>0.05)，治疗后，联合治疗组KPS评分显著高于异体CIK细胞治疗组(P<0.01)，见表4。

表2 两组患者治疗前后的免疫功能变化情况比较

注：*P<0.05 (治疗前 vs 治疗后)；#P<0.05 (CIK vs CIK-PE)

表3 两组患者的

注：*P<0.05 (治疗前 vs 治疗后)；#P<0.05 (CIK vs CIK-PE)

表4 两组患者治疗前后的KPS评分变化情况比较

注：*P<0.05 (治疗前 vs 治疗后)；#P<0.05 (CIK vs CIK-PE)

3 讨论

随着肿瘤治疗学的不断发展及进步，肿瘤免疫治疗备受关注，于2013年被Science评选为10项重大突破之首。其中细胞免疫治疗异军突起，通过改善患者的免疫系统功能，达到间接治疗肿瘤的目的，成为肿瘤免疫治疗的主要方案。细胞免疫治疗主要包括细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞、树突状细胞(DC)、自然杀伤(NK)细胞、淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)、肿瘤浸润细胞(TIL)等[6]。目前临床容易制备且应用广泛的就是CIK细胞，其具有肿瘤细胞杀伤活性的NK样T细胞作用，临床应用安全，能够更广泛的适合临床治疗需求[7，8]，但在CIK细胞治疗肿瘤的疗效仍受多种因素限制，如肿瘤患者体内存在大量细胞免疫抑制因子IL-4、IL-10及促肿瘤生长因子TGF-β及VEGF等，影响CIK细胞治疗疗效[9]。

IL-10主要是一种免疫抑制因子，通过多种途径抑制机体的抗肿瘤免疫效应[10]。VEGF具有促肿瘤血管新生作用，同时干扰树突细胞、B细胞和T细胞的抗原呈递作用，引起肿瘤细胞发生免疫逃逸。肿瘤细胞同时又具有分泌的IL-10、VEGF和TGF-B等功能，能刺激巨噬细胞向M2型巨噬细胞分化，反过来分化形成的M2型巨噬细胞于肿瘤细胞相互作用，共同分泌大量的IL-10、VEGF和TGF-β因子，抑制机体的抗肿瘤免疫效应[11]。IL-4为另一种免疫抑制因子，其主要通过3种负向调节方式抑制γδT细胞的免疫应答作用:①抑制γδT细胞的活化作用；②促使γδ T细胞向Vδ1 T细胞偏倚，产生的Vδ1 T细胞能够大量分泌IL-10，间接抑制具有强细胞毒活性的Vδ2 T细胞的增殖，从而抑制γδT细胞的抗肿瘤活性[12]；③IL-4还抑制Vδ1T细胞表达杀伤性受体NKG2D[8]。本实验通过回输CIK细胞治疗、血浆置换等治疗，观察发现，患者CIK治疗前后，CD3+和CD4+细胞比例和CD4+/CD8+比值明显上升，CD8+细胞比例下降，差异有统计学意义，与单纯异体CIK治疗组比较，异体CIK联合血浆置换治疗免疫功能改善更为明显，差异有统计学意义，以上结果说明CIK细胞治疗可以改善患者免疫功能，在清除免疫抑制因子和促瘤因子的条件下，CIK细胞治疗更能发挥其抗肿瘤的免疫效应。在治疗2疗程后，两组患者的IFN-γ无明显下降，差异无统计学意义，提示血浆置换后虽然下调了IFN-γ量，但CIK细胞输注后能弥补细胞因子IFN-γ量的不足，一定程度上上调了免疫功能，而IL-4、IL-10、TGF-β及VEGF水平均有不同程度的下降，其中联合治疗组患者的下降程度明显高于单纯异体CIK组，差异有统计学意义，证明了在清除免疫抑制因子和促瘤因子的条件下，血浆置换有利于放大CIK细胞生物治疗疗效。

针对晚期肿瘤患者，由于目前还不能从根本上治愈，所以为使患者带瘤长期生存，应选择不良反应少、耐受性良好且能改善生活质量的方案，在选择治疗方案时应重视多学科综合治疗的策略，制定合理的、个体化综合治疗方案，延长生存期的同时，改善患者生活质量更为重要[13]。本研究结果提示：两组患者OS无差别，但联合治疗组PFS长于单纯CIK治疗组，且联合治疗组KPS评分显著高于异体CIK细胞治疗组，即联合治疗组患者获得了更长时间的PFS，达到了晚期肿瘤患者以改善生活质量为主的目的。

综上，将两种成熟的医疗技术即CIK细胞治疗与血浆置换(PE)技术有机的结合，有可能为临床治疗肝癌提供新策略。

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Clinical study of allogeneic CIK combined with plasma exchange in the treatment of advanced primary liver cancer

HOUJun-jie,YANGYing,LIXiao-nan,etal.

(JilinProvincePeople’sHospital,Changchun130021,China)

Objective To study the effect and mechanism of allogeneic CIK combined with plasmapheresis in the treatment of liver cancer.Methods Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were isolated from healthy volunteers and cultured in vitro by culturing the cells into cytokine-induced (CIK) cells.All cases were randomly assigned to allogeneic CIK cell treatment group and allogeneic CIK + plasma replacement therapy group.The levels of IFN-γ,IL-4,IL-10,TGF-β and VEGF in plasma were measured by ELISA.The percentage of CD3+and CD4+cells in the peripheral blood of the two groups before and after treatment were detected by flow cytometry.CD4+/CD8+ratio and CD8+cell ratio,and the quality of life and overall survival of the two groups were compared.Results The anti-tumor immunity effect of allogeneic CIK was up-regulated,and the up-regulation of IL -4,IL-10,TGF-β and VEGF was related to the up- regulation of CIK + plasma replacement therapy group (P<0.05);The percentage of CD3+,CD4+and CD4+/CD8+in peripheral blood in CIK+plasma replacement group were significantly higher than those in allogeneic CIK group(P<0.05),and the percentage of CD8+cells decreased significantly after treatment(P<0.05),PFS has been prolonged(P<0.05) and no OS prolongation(P>0.05),and quality of life was significantly better than that of allogeneic CIK cells treated group(P<0.01).Conclusion Adoptive CIK cell adoptive immunotherapy + plasma exchange program can inhibit and remove immunosuppressive cells and immunosuppressive factors,increase the immune effect and quantity of CIK cells,inhibit the progression of primary liver cancer and improve the quality of life of patients.

Hepatitis；Atorvastatin；Plasma exchange；Liver function

1007-4287(2017)01-0050-04

吉林省科技厅项目(20140520037JH，20140519018JH，20140414043GH)、吉林省人社厅省人才开发资金(2016年度)及吉林省科技厅重点实验室项目(20122113)资助

R735.7

A

2016-04-14)

*通讯作者