方 葆 沈国森 郭 珍*

RNA降解复合体是RNA在生物体内更新的主要工具。信使RNA（mRNA）的更新对蛋白的表达起重要作用，其调控多种生理学过程。作者自2015年5月至2016年7月通过对绿脓杆菌RNA降解蛋白PNPase与RNase E进行克隆表达纯化，并获取复合物蛋白，以期揭示PNPase与RNase E对绿脓杆菌RNA的降解机制。

1 材料与方法

1.1 材料与方法 载体pW28由pET28a改造而来、载体PGEX-6p-2、E.coli菌株DH5α、E.coli BL21（DE3），基因组模板从绿脓杆菌PAO1标准菌株中提取。

1.2 工具酶及试剂 限制性内切酶 BamH I、Hind III和Xho I、ExTaqDNA 聚合酶、DNA纯化试剂盒购自PROMEGA 公司，质粒抽提试剂盒购自 OMEGA 公司；Ni-NTA亲和层析胶、GST亲和层析柱、DEAE 层析柱、分子筛 Superdex 75 购自 GE 公司。试剂 IPTG 等均为国产分析纯。

1.3 引物设计 对PNPase与RNase E基因序列分析及应用Primer 5软件进行PCR引物设计，限制性内切酶分别为 BamH I、Hind III和 BamH I、Xho I。

表1 PCR扩增所用的引物及其序列

1.4 PCR扩增目的基因 用绿脓杆菌PAO1的基因组为模板，PCR扩增PNPase与RNase E，反应条件均为：95℃预变性5min，95℃变性50s、57℃退火45s、72℃延伸1min，30个循环，72℃延伸10min，4℃保存；PCR产物进行1%琼脂糖电泳分析；用PCR 产物纯化试剂盒回收、纯化目的基因片段；用限制性内切酶 BamH I，Xho I与BamH I、Xho I对纯化后 PCR产物、载体pW28与载体PGEX-6p-2双酶切，并用DNA 纯化试剂盒进行回收、纯化。

1.5 重组质粒的构建 纯化双酶切（BamH I + Hind III与BamH I+Xho I）后的PCR产物和载体pW28、载体PGEX-6p-2，用T4DNA连接酶在16金属浴中连接16 h，再将连接产物转化至感受态E.coli DH5a中。PNPase：涂布于含50 mg/L卡那霉素的LB平板上，培养并提取质粒；RNase E：涂布于含100 mg/L氨苄霉素的LB平板上，培养并提取质粒。经菌液PCR、质粒双酶切及测序鉴定筛选阳性单克隆，再转化至表达用感受态E.coli BL21中进行诱导表达。

1.6 PNPase与RNase E的诱导表达 将转化后的大肠杆菌BL21（PNPase、RNase E）接种于LB培养基（PNPase：50 mg/L卡那霉素；RNase E：100 mg/L氨苄霉素）中，培养至A600nm约为0.6，加入终浓度为0.2mmol/L IPTG，于18℃低温诱导表达12h，离心收集菌体，-80℃冻存。

1.7 PNPase的纯化 冰浴，超声破碎离心后的菌体，4℃，12 000 r/min，离心30min收集上清液。上清液通过预先用结合缓冲液平衡过的Ni-NAT-Sepharose Fast Flow column，然后用200ml洗涤缓冲液（20mmol/L Tris-HCl，300mmol/L NaCl，pH8.0，25mmol/L 咪唑）洗涤杂蛋白，最后用洗脱缓冲液（20mmol/L Tris-HCl，pH8.0，250mmol/L咪唑）洗脱目的蛋白。为进一步提高蛋白纯度，再用DEAE-Sepharose Fast Flow和Superdex 200分子筛纯化，将纯化后的PNPase蛋白质在超滤杯中脱盐、脱咪唑，浓缩至体积约为5ml，并用BCA法检测蛋白质浓度约为30mg/ml。

1.8 PNPase与RNase E相互作用 冰浴，超声破碎离心后的菌体（RNase E），4℃，12000r/min，离心30 min收集上清液。上清液通过预先用结合缓冲液平衡过的GST亲和层析柱中，4℃，冰上轻摇孵育12h，使GST-RNase E融合蛋白与GST层析柱充分结合。让GST亲和层析柱中液体自然流出，再用Binding Buffer（20mM tris-HCl、pH8.0、50mMNaCl）充分洗涤层析柱中未结合的杂蛋白并平衡层析柱；取脱盐、脱咪唑、浓缩后的PNPase蛋白质加入经RNase E蛋白质结合的GST层析柱上，4℃，孵育8h，RNase E与PNPase充分结合。让GST亲和层析柱中的液体自然流出，用Binding Buffer（20mM tris-HCl、pH8.0、50mMNaCl）充分洗涤GST亲和层析柱；用20ml PPase加入GST亲和层析柱中，切掉GST标签，并让柱中的液体自然流出；用5ml的谷胱甘肽作为洗脱液洗脱与GST层析柱结合的蛋白质；脱盐、脱咪唑、浓缩；留样进行SDSPAGE电泳。

2 结果

2.1 PCR扩增目的基因与重组质粒的构建 PNPase：1%琼脂糖核酸电泳结果显示，PCR扩增的片段长度大约为1700bp，与目的片段长度相吻合（见图1A）；PCR产物和载体pW28连接后，经过菌液PCR，重组质粒经BamH I + Hind III双酶切后核酸电泳鉴定，与预期结果一致（见图1B）。RNase E：1%琼脂糖核酸电泳结果显示，PCR扩增的片段长度大约为1700bp，与设计的目的长度吻合（见图1A）。PCR产物和载体PGEX-6p-2连接后，经过菌液PCR，重组质粒经BamH I+Xho I双酶切后核酸电泳鉴定，与预期结果一致（见图1B）。重组质粒送往北京华大基因测序中心测序，结果表明所构建的质粒完全正确。表明成功构建PNPase与RNase E表达质粒。

图1 A：1%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物；B：重组质粒酶切鉴定

2.2 PNPase的 纯化 PNPase与 RNase E分别低温诱导表达后，对 PNPase进行纯化。冰浴，超声破碎离心后的菌体，4℃，12000r/min，离心30min收集上清液。因载体pW28中含His标签PNPase用Ni-NAT-Sepharose Fast Flow column进行初步纯化，25mmol/L低浓度咪唑洗脱非特异性结合蛋白，250mmol/L高浓度咪唑洗脱目的蛋白。SDS-PAGE电泳显示PNPase得与镍离子亲和层析柱结合良好，为进一步提高PNPase的纯度，继续用DEAE-Sepharose Fast Flow和Superdex 200分子筛纯化，SDS-PAGE检测蛋白纯度得到进一步提高。将纯化后的PNPase蛋白质在超滤杯中脱盐、脱咪唑，浓缩至体积约为5ml，并用BCA法检测蛋白质浓度约为30mg/ml。SDSPAGE电泳显示，表达蛋白位于约60kD处，该实验目的蛋白59.5kD，加上融合的6个his标签，条带位置相吻合。见图2。

图2 PNPase蛋白的表达与纯化效果图

2.3 PNPase与RNase E相互作用 GST-RNase E融合蛋白与GST层析柱充分结合，让GST亲和层析柱中液体自然流出后，50mMNaCl洗涤层析柱中未结合的杂蛋白；再加入脱盐、脱咪唑、浓缩后的PNPase蛋白质至GST层析柱上，4℃，孵育8h，使RNase E与PNPase充分结合；再用50mMNaCl的Binding Buffer洗涤GST亲和层析柱；用PPase切掉GST标签，并让柱中的液体自然流出；用5ml的谷胱甘肽作为洗脱液洗脱与GST层析柱结合的蛋白质；脱盐、脱咪唑、浓缩、SDS- PAGE电泳。PNPase无GST标签，其不与GST亲和层析柱结合，结合上的就是与GST柱上的RNase E结合。SDS-PAGE电泳显示，通过Pulldown，PNPase的量明显下降，PNPase与RNase E能在50mM、100mM、200mM和300mM NaCl条件下结合，由此表明PNPase与RNase E在体外相互作用。见图3。

图3 PNPase与RNase E的体外结合

3 讨论

在真核生物中，mRNA主要由外核体蛋白复合物从3'到5'方向降解。而类似的，在细菌中，与真核外核体蛋白复合物有类似结构域的聚核苷酸磷酸化酶（即PNPase）对原核mRNAs的降解起关键作用［1］。PNPase是一种进化保守的酶，几乎存在于除酵母、锥虫和古细菌外的所有物种中［2］。PNPase是一个3'到5'方向的核酸外切酶，磷酸盐催化RNA的磷酸解作用，产生分解产物二磷酸核苷。PNPase降解或合成的活性方向主要由二磷酸核苷和磷离子的相对浓度控制［3］。在大肠杆菌中，PNPase主要与RNase E、RhlB和烯醇化酶等形成RNA降解复合物起作用，PNPase可以非特异性地持续降解RNA3'端的核苷酸，但当遇到像茎环一样的链RNA结构就会停止［4］。研究发现，RNase E参与此降解过程的调控［5-8］。Salima等对大肠杆菌PNPase的结构研究显示PNPase核心区域形成一个三同聚体环形结构包围着一个大中心通道。RNase E的微区域通过氢键与PNPase PH区域形成反向平行的β折叠片中微区域（第327-331位氨基酸残基）相互作用［9］。在细菌中，有两个RNase E抑制因子（RraA和RraB）通过与降解体结合从而影响复合物的成分和调节酶性质。这些蛋白似乎是通过与RNase E的非催化区域相互作用而在体内和体外抑制RNase E的活性，其可以减少RNA降解复合体上PNPase的量［10］。本文成功构建了RNase E-PGEX-6p-2重组表达质粒，并表达GST-RNase E的融合蛋白。通过Pull-down，成功验证绿脓杆菌RNase E与PNPase相互结合。并在50mM NaCl浓度下得到PNPase-RNase E蛋白的稳定复合物。原核表达系统具有方便快捷及成本便宜等优势，本课题组首次采用原核表达系统来制备PNPase-RNase E复合物，为开展三维结构和相关功能研究的奠定基础。

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