蒋 璐 成伯宁*

辣椒素是从辣椒属植物中得到的红辣椒的活性成分，其特点为辛辣，是辣味的主要成分，化学结构式：H3CO（HO）-C6H3-CH2-NH-CO-（CH2）4=CHCH（CH3）2，即反式8-甲基-N-香草基-丁-壬烯胺；分子量305，属酰胺类化合物。辣椒素纯品呈单斜长方形片状无色晶体，熔点65℃，沸点210℃～220℃，易溶于乙醇、乙醚、苯以及氯仿，微溶于二硫化碳。辣椒素具有多种药理活性，如止痛［1］、降脂［2］、减肥［3］及抗肿瘤等作用，近年来国内外研究结果表明，辣椒素对多种肿瘤细胞具有抑制生长和增殖的作用，祝丽丽等［4］研究表明，辣椒素可抑制结肠癌HT-29细胞裸鼠皮下移植瘤的生长，诱导细胞凋亡。唐忠志等［5］报道，在体外辣椒素对人胃癌MKN-45细胞有明显的抑制生长作用，并呈剂量、浓度依赖性。但辣椒素对食管癌EC109细胞是否具有抗肿瘤效果，目前研究较少，本课题从细胞增殖及凋亡角度，从体内外探讨辣椒素是否具有抗食管鳞状细胞癌的作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和细胞 辣椒素（Santa Cruz公司）；CCK-8试剂盒与细胞周期检测试剂盒（南京凯基生物发展有限公司）；Tunnel凋亡试剂盒（Roche公司）；鼠源单克隆抗体Ki-67（Sigma公司）；人食管癌EC109细胞株购自ATCC。

1.2 辣椒素的配制与细胞培养 将辣椒素溶解在乙醇中，配成300μmol/L的溶液，置于-20℃冰箱保存。临用时，以完全培养液稀释辣椒素至所需浓度。对照组培养液为含体积分数10%小牛血清的RPMI 1640培养液。EC109细胞培养于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI1640培养基中，37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养。

1.3 CCK-8法检测细胞增殖 收集对数生长期的EC109细胞，经胰酶消化后吹打成单细胞悬液，调整浓度为1×104个/ml，接种于96孔培养板中，每孔0.1ml，24h后分别加入含浓度依次为5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg辣椒素的培养液，并设置对照组，其他浓度者为实验组。继续培养48h后，每孔各加入10μl的CCK-8试剂，继续培养4 h，在450nm波长处测定吸光度（A），参比波长为600nm。每组设6个复孔，实验重复3次。计算细胞存活率。细胞存活率（%）=（实验组A450值-空白调零组A450值）/（对照组A450值-空白调零组A450值）×100%。

1.4 流式细胞术检测细胞周期的分布 将对数生长期EC109细胞以4×105个细胞数接种于6孔板中，当细胞满80%时，不同浓度的辣椒素（5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg）处理细胞48h，同时设对照组，药物处理后，用胰酶消化，制成单细胞悬液，以PBS缓冲液清洗2次，用70% 冷乙醇4℃固定过夜。300r/min离心10min去除乙醇固定液，冷PBS冲洗细胞3次，加入终浓度为80mg/ml的RNase A，37℃反应30min；细胞冰冻10 min，然后加入50 mg/ml PI，室温避光反应1h后，流式细胞仪检测，激发波长488nm发射波长530nm，实验重复3次，Cell quest软件分析。

1.5 食管鳞状细胞癌EC109细胞裸鼠皮下移植瘤模型建立 将4×106个EC109细胞悬浮于0.2ml含有25%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，注射至裸鼠背部靠近右侧后肢皮下，建立人胰腺癌裸鼠移植瘤模型。接种4～5周后，待移植瘤体积长至100～150mm3，将裸鼠按肿瘤体积大小排序并随机区组设计分成4组：生理盐水（0.2ml/只）组、低剂量（5mg/kg）组、中剂量组（10mg/kg）、高剂量组（20mg/kg），每组各15只。各组均采用腹腔注射给药，药物注射的最终体积为0.2ml/只，分组当天开始腹腔注射给药，1次/3d，共11次；给药期间每周使用游标卡尺测量肿瘤结节的长（A）、宽（B）和高（C），估算肿瘤近似体积［V=π（A×B×C）/6］；给药结束后1周，用10%水合氯醛麻醉裸鼠，取出皮下移植瘤称重，并测量肿瘤体积。

1.6 TUNNEL法检测各组移植瘤内细胞凋亡情况 取出制备好的石蜡切片。对各组标本的同一横截面进行连续切片，所得石蜡切片进行常规二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，按照Tunel试剂盒所示的操作步骤进行操作；Tunel染色后阳性细胞的镜下表现为细胞核染成棕褐色，胞核固缩，染色质浓缩，而胞浆不着色；在高倍镜下（OLYMPUS BX51，400×）随机选择10个视野，图片经Image-pro plus 6软件处理分析后，阳性细胞比例采用累积吸光值（IOD）表示，吸光值越大表明凋亡细胞数越多。

1.7 免疫组织化学法检测各组瘤体内Ki-67的阳性表达指数 石蜡切片常规脱腊水化，0.3% H2O2封闭，微波抗原修复，滴加正常山羊血清封闭液，Ki-67抗体室温20min；4 ℃孵育过夜，PBS 洗涤三次，滴加HRP标记的二抗37℃ 30min，PBS 再次洗涤三次，DAB 显色3-5min，冲洗后苏木素复染，流水冲洗返蓝后脱水封。图片结果用Ipp-6图像处理软件进行分析平均光密度。

1.8 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件。计量资料以（s）表示，组间比较采用t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度的辣椒素对食管鳞状细胞癌EC109细胞增殖抑制情况 不同浓度辣椒素（5、10、20mg/kg）处理食管鳞状细胞癌EC109细胞48h，CCK-8法检测细胞增殖情况如图1所示：低剂量组EC109细胞存活率为（88.45±7.45）%；中剂量组EC109细胞存活率为（75.41±6.75）%；高剂量组EC109细胞存活率为（62.27±5.37）%；均具有明显的增殖抑制作用，并呈现浓度依赖现象。

图1 不同浓度的辣椒素对食管鳞状细胞癌EC109细胞增殖抑制情况

2.2 不同浓度的辣椒素对食管鳞状细胞癌EC109细胞周期的影响 不同浓度辣椒素处理食管鳞状细胞癌EC109细胞48h，流式细胞术检测细胞周期的分布如图2所示：对照组G0/G1比例为（58.61±4.25）%；低 剂量组G0/G1比例为（69.32±5.05）%；中剂量 组G0/G1比例为（77.18±4.74）%；高剂量组G0/G1比 例 为（91.02±5.34）%；对 照 组 G2/M+S比 例 为（41.39±4.37）%；低 剂 量 组G2/M+S比例 为（30.68±4.75）%；中 剂 量 组G2/M+S比 例为（22.82±5.96）%；高 剂 量 组G2/M+S比 例 为（8.98±4.62）%。G2/M%+S%反映了细胞增殖能力，由此可见辣椒素通过改变EC109细胞周期的分布，抑制细胞增殖作用。

图2 不同浓度的辣椒素对食管鳞状细胞癌EC109细胞周期的影响

2.3 各组裸鼠皮下移植瘤瘤体体积变化情况 食管鳞状细胞癌EC109细胞裸鼠皮下移植瘤接种第四周（28d）开始随机分组药物处理，如图3所示：药物处理前各组裸鼠皮下移植瘤体积无明显差异（P＞0.05）；给药的过程中，各组之间差异性逐渐明显，给药结束后1周测量瘤体体积，对照组为（1.36±0.24）cm3；低剂量组为（0.91±0.21）cm3，抑瘤率为0.33%；中剂量组为（0.73±0.18）cm3，抑瘤率为0.46%；中剂量组为（0.39±0.13）cm3，抑瘤率为0.71%；辣椒素对EC109细胞具有抑制瘤体生长的作用，其抑制效果呈现明显的浓度依赖现象。

图3 各组裸鼠皮下移植瘤瘤体体积变化情况

2.4 Tunnel法检测瘤体内细胞凋亡情况 与对照组IOD值为（28.3±2.16）相比较，低剂量组组IOD值为（43.1±2.81），中剂量组IOD值为（63.4±3.12），高剂量组IOD值为（107.3±7.31），可见对照组细胞核少数阳性表达，低剂量组细胞核阳性表达明显增多，高剂量组最明显；免疫组化法检测各组瘤体内Ki-67的阳性表达，Ki-67是细胞的核增生抗原，反应细胞增生情况，如图4所示：对照组阳性率较高，表明增生活跃，随着辣椒素浓度的递增，胞核阳性率表达明显降低，高剂量组只有少数细胞核有阳性表达。

图4 Tunnel法检测瘤体内细胞凋亡情况﹑免疫组化法检测各组瘤体内Ki-67的阳性表达

3 讨论

食管癌是常见的消化道恶性肿瘤之一。我国是食管癌高发地区，以鳞癌为主，腺癌发病率未见明显增高趋势［6］，目前新发病例中，＞90%为鳞癌，食管癌已成为我国卫生部确定的十大特色肿瘤之一。根治性手术是食管癌最有效的治疗手段，患者一旦出现吞咽困难等临床症状时，绝大多数已属于晚期，错过根治性手术机会；放疗是晚期食管鳞癌及上段鳞癌最重要的治疗手段，但由于放疗剂量的要求及放疗相关性损伤的存在，明显限制了放射性治疗的应用，食管鳞癌对化疗欠敏感，且其毒副作用较大，应用有限。

辣椒素是红辣椒中主要成分之一，来源广泛，并且毒副作用较小，已有研究表明，辣椒素具有抗直肠癌、胃癌等作用，但辣椒素抗食管鳞癌的相关研究较少，本课题旨在探讨辣椒素是否对食管鳞癌具有抗肿瘤作用，首先在体外运用CCK-8、流式细胞术等技术，检测不同浓度辣椒素处理后对食管鳞癌在细胞增殖及细胞周期的方面的影响，发现辣椒素具有抑制食管鳞癌EC109细胞增殖的作用，也可扰乱细胞的正常周期，使G0/G1期细胞数目相应增加，并均具有浓度依赖性。为进一步探讨辣椒素抗食管鳞癌的作用，课题组建立了食管鳞癌EC109细胞的裸鼠皮下移植瘤动物模型，测量瘤体体积，计算抑瘤率，发现辣椒素具有抑制瘤体生长的作用。

Tunnel法［7］，即末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP 缺口末端标记测定法，也称DNA 断裂的原位末端标记法，这一方法能对DNA分子断裂缺口中的3'-OH进行原位标记，DNA分子断裂缺口的暴露意味细胞凋亡的增加，本课题运用Tunnel法发现辣椒素具有促进瘤体内EC109细胞的凋亡；Ki-67是表达于核表面与增生相关的抗原，其表达量的增加表明细胞增生活跃［8］；课题组运用Tunnel法及Ki-67的检测，发现辣椒素对EC109细胞裸鼠皮下移植瘤具有增殖抑制作用，及凋亡促进作用。

［1］ 邓海峰,石丽宏．辣椒素减轻硬膜外麻醉后腰痛的临床观察．临床麻醉学杂志,2007,23(11):939．

［2］ 聂乾忠,夏延斌,曾晓楠,等．辣椒素类物质对高脂血症大鼠血脂的影响．食品与机械,2010,26(1):77-80．

［3］ Kasbia Gursevak S．Functional foods and nutraceuticaisin the management of obesity．Nutrition&Food Science, 2005,35(5):344-352．

［4］ 祝丽丽,胡万乐,张林君,等．辣椒素对结直肠癌裸鼠皮下移植瘤的抑制作用及机制．中华肿瘤杂志,2013,35(4):256-261．

［5］ 唐忠志,李军尧,陈晓娟．辣椒素诱导人胃癌MKN-45细胞凋亡及其分子机制的研究．实用医学杂志,2007,23(24):3822-3825．

［6］ Shibata A, Matsuda T, Ajiki W, et al． Trend in incidence of adenoearcinoma of the esophagus in japan, 1993-2001． Jpan J Clin Cneol, 2008,38(7): 464-468．

［7］ 刘爽,刘大川,李非,等．Tunel法检测胰腺癌细胞凋亡和Ki-67表达的研究．首都医科大学学报,2003,24(3),307-309．

［8］ Mastronardi L,Guiducci A,Puzzilli F,et al．Relationship between Ki-67 labeling indes and survival in high-grade glioma patients treated after sergery with tamocifen．J Neurosurg Sci,1999,43(4):263-270．