林旭红， 王慧超， 郭俊玲， 房晓鹏， 张俊士， 郭俊楠， 李玉霞， 杨瑞林， 李铁军， 刘建林

(河南大学 1淮河医院检验科，转化医学中心， 2第一附属医院肾内科，3淮河医院心内科， 4医学院， 5淮河医院神经内科，河南 开封 475000)

·论 著·

ATP介导的嘌呤能信号在阿尔茨海默病相关结肠运动障碍中的作用*

林旭红1， 王慧超2△， 郭俊玲3,4， 房晓鹏1， 张俊士5， 郭俊楠5， 李玉霞1， 杨瑞林1， 李铁军2， 刘建林2

(河南大学1淮河医院检验科，转化医学中心，2第一附属医院肾内科，3淮河医院心内科，4医学院，5淮河医院神经内科，河南 开封 475000)

目的： 探讨ATP介导的嘌呤能信号在阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)相关结肠运动障碍中的作用及其相关的分子机制。方法:(1)临床试验：收集我院20例AD患者进行研究，放射免疫法测定血浆中胃动素(motilin，MTL)、胆囊收缩素(cholecystokinin，CCK)、血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide，VIP)和一氧化氮(nitric oxide，NO)水平；高效液相色谱法(high-performance liquid chromatography，HPLC)检测血浆三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)水平，同时对患者进行神经心理学检查并积分。(2)动物实验：利用AD小鼠进行Morris水迷宫实验，评估空间学习记忆功能；放射免疫法测定血浆中MTL、CCK、VIP和NO水平，HPLC法检测血浆ATP水平；免疫组织化学法检测乙酰胆碱转移酶(choline acetyltransferase，ChAT)、VIP、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)和ATP合酶的变化；Western blot和免疫组化法检测P2Y受体表达水平的变化。(3)离体实验：离体器官浴槽系统观察P2Y受体激动剂α,β-亚甲基ATP(α,β-methylene ATP, α,β-MeATP)对自发性及电刺激诱导的结肠平滑肌收缩的影响，细胞内微电极技术观察α,β-MeATP对结肠平滑肌细胞膜电位的影响。结果:与对照组比较，AD患者血浆的MTL和CCK水平明显降低(P<0.01)，NO和ATP水平显著升高(P<0.05或P<0.01)，VIP无明显变化。患者简明精神状态检查积分(MMSE)降低(P<0.05)，AD评定量表-认知分量表(ADAS-Cog)积分、神经精神问卷(NPI)积分和AD协作研究日常能力量表(ADCS-ADL)积分均明显高于对照组(P<0.01)。AD小鼠4～6 d逃逸潜伏期明显延长(P<0.05)，空间探索能力明显降低(P<0.05)，AD小鼠血浆中MTL和CCK水平明显降低(P<0.01)，NO和ATP水平显著升高(P<0.05或P<0.01)，VIP无明显变化，AD小鼠结肠表达ATP合酶的水平明显上调(P<0.05)，但ChAT、VIP和NOS无明显改变，同时P2Y受体表达水平升高(P<0.01)。体外实验表明，α,β-MeATP呈浓度依赖性抑制对照组和AD组小鼠结肠平滑肌自发性收缩(P<0.05或P<0.01)，且这种抑制作用可被Na+通道阻断剂河豚毒素(tetrodotoxin，TTX)逆转(P<0.05或P<0.01)，α,β-MeATP在100 μmol/L时对AD小鼠自发性收缩的抑制作用更明显(P<0.05)，AD小鼠与正常小鼠比较，TTX对100 μmol/L的α,β-MeATP的拮抗作用差异也有统计学显著性(P<0.05)。在10 Hz电刺激诱导的结肠平滑肌收缩中，α,β-MeATP抑制正常小鼠和AD组小鼠的收缩(P<0.05或P<0.01)，且40 μmol/L和100 μmol/L时对AD小鼠的抑制作用比正常小鼠明显(P<0.05或P<0.01)。平滑肌细胞膜电位实验显示，α,β-MeATP不影响结肠平滑肌膜电位(P>0.05)。结论:AD患者和AD小鼠血浆中促进胃肠运动的激素MTL和CCK水平降低，抑制胃肠运动的激素NO水平升高，胃肠总体运动功能被抑制；AD小鼠血浆ATP水平升高，同时ATP嘌呤能神经元增加，P2Y受体表达上调；在AD发病中，ATP介导的嘌呤能信号可能通过抑制结肠平滑肌收缩，从而导致结肠运动功能障碍。

P2Y受体； 阿尔茨海默病； 肠神经系统； 结肠运动障碍

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)又称早老性痴呆，是典型的神经退行性疾病，以进展性脑部神经丢失为特征，伴随细胞外淀粉样肽斑块等明显病理改变，最终导致严重的认知缺陷和记忆减退，并呈进行性加重[1]。随着人口老龄化进程加快，AD患者越来越多，不但影响人们生活质量，威胁人类晚年健康，而且将成为严重危害人类生活和阻碍社会发展的重大问题。

目前临床尚无可靠的指标早期确诊AD，只能在认知缺陷发生后进行AD的可靠诊断，而临床症状出现后，组织改变和丢失已经非常严重，以至于不能逆转，这是导致患者不能顺利进行早期治疗的关键，也是临床所有AD的治疗仅能减轻症状，而不能阻断疾病进展的主要瓶颈[2]。因此寻找尽早诊断AD的敏感度高、特异性强的方法，增加治疗效应的机会，成为AD研究领域亟待解决的问题[3]。

肠神经系统(enteric nervous system，ENS)是独立于大脑之外的外周神经系统的最大部分，包括上百万感觉、中间和运动神经元，有与脑组织相同的疾病相关性，促进整个胃肠道活动，且ENS容易通过抽吸等方式进行活检，因此是传递神经系统真实状态有价值信息[4]的部位。目前已在帕金森病(Parkinson’s disease，PD)及其模型中发现ENS的改变，如过表达synuclein[4]、多巴胺分布的丢失[5]、胃肠道运动功能性缺陷[6-7]等。Sprenger等[8]比较了正常人、PD、PD前驱期特发性快速眼动睡眠行为障碍(idiopathic REM sleep behavior disorder，iRBD)等人群结肠组织synuclein免疫染色，发现在3组都有表达，而p-synuclein仅在iRBD组表达，提出p-synuclein可能是高危人群PD前驱期合适的组织标志物。作为肠运动功能的指挥者，ENS在AD小鼠淀粉样前体蛋白表达早期发生中也经历明显的变化，且变化早于脑组织变化[9]。这些研究提示ENS有望成为AD早期组织学诊断的替代指标。ENS内神经元可通过分泌兴奋性神经递质如P物质(substance P，SP)、乙酰胆碱(acetylcholine，ACh)和5-羟色胺(5-hydroxytryptamine或serotonin，5-HT),以及抑制性神经递质如一氧化氮(nitric oxide，NO)、血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide，VIP)和三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)，调节肠道功能。根据递质的不同，神经元可分为胆碱能神经元、肾上腺素能神经元、NO及VIP抑制性非肾上腺能非胆碱能神经元和ATP介导的嘌呤能神经元等，近年来,对ENS中研究最多的抑制性神经递质是VIP和NO，而对于ATP的研究很少[10-11]。

ATP的功能并不局限于单一的能量单位，还可以作为一个信号分子参与细胞之间的交流，同时被释放的ATP能够行使神经递质和神经调质的作用，参与细胞的增殖、分化、迁移和凋亡等。ATP在细胞上的生物学作用主要是由细胞膜上的嘌呤能P2受体来介导的[12]。嘌呤能P2受体家族分为离子通道P2X受体和G蛋白偶联的促代谢型P2Y受体。有研究表明，ATP可能是通过P2X或P2Y嘌呤能受体，激活细胞内某些信号传导进而影响成纤维细胞增殖[13];敲除P2Y1受体，小鼠胃、盲肠和结肠均缺乏嘌呤能神经肌肉转运[14-15]；大鼠结肠中，抑制性神经肌肉转运也由P2Y1受体介导[16]。但是AD患者胃肠道功能变化过程中嘌呤能信号的变化及机制，目前未见相关报道。本文通过临床试验、动物实验及体外组织实验重点探讨ATP介导的嘌呤能信号在AD患者结肠运动障碍中的作用及机制。

材 料 和 方 法

1 AD患者收集及临床信息采集

根据2011年美国国立老化研究所和阿尔茨海默病协会修订的标准，收集我院可能的20例AD患者，男性13例，女性7例，平均年龄(67.65±1.93)岁，并选择20例健康人作为对照。AD的纳入标准：(1)有认知损害病史如失语或者情绪障碍等；(2)表现为学习和(或)记忆下降；(3)存在视空间或执行功能的损害等；(4)进行正规神经心理学测验提示AD；(5)影像学检查符合AD的相关改变。同时排除以下情况：(1)既往卒中史、存在多发或广泛脑梗死或存在严重的白质病变等；(2)有路易体痴呆的显著特征；(3)有额颞叶痴呆的核心症状；(4)有原发性进行失语的表现；(5)有其它引起进行性记忆和认知功能损害的相关疾病；(6)既往过量或滥用药物病史。

2 动物及分组

6～8月龄C57 BL/6J小鼠(雌雄各半)16只，购自河南大学实验动物中心，AD转基因小鼠模型即APP/PS1 基因突变小鼠购自南京大学模式动物研究所(由JAX 实验室引进)，实验前禁食不禁水12 h。所有操作程序均获得河南大学医学伦理委员会批准。

3 实验方法

3.1 放射免疫测定血浆中胃动素(motilin，MTL)、胆囊收缩素(cholecystokinin，CCK)、VIP和NO水平 按照试剂盒操作说明，用放射免疫法分别检测各组标本血浆MTL、CCK、VIP和NO水平。

3.2 HPLC法检测血浆ATP水平 参照Sperlagh等[17]的方法设置参数，流动相为磷酸盐缓冲液(100 mmol/L K2HPO4)，采用等度洗脱，色谱柱用Eclipse XDB-C18柱，流速为每分钟0.6 mL，进样量10 μL，254 nm检测。血浆加入等比例7% HClO4，经离心留取上清，用 10% KOH中和至pH 7.0，离心后直接上柱分析。同时做标准曲线，测定峰面积，计算样品浓度。

3.3 神经心理学检查 采用简明精神状态检查(Mini-Mental State Examination，MMSE)、阿尔茨海默病评定量表认知分量表 (Alzheimer’s Disease Assessment Scale-Cognitive Subscale，ADAS-Cog)、 神经精神问卷(Neuropsychiatric Inventory，NPI)、阿尔茨海默病协作研究日常能力量表(Alzheimer’s Disease Cooperative Study-Activities of Daily Living Scale， ADCS-ADL)等对患者进行神经心理学检查并积分。MMSE包括定向力、记忆力、注意及计算力、回忆和语言5个方面的检测，主要评估患者的认知功能， 评分从0分到30分，得分越高说明认知功能越好。ADAS-Cog可有效评估患者的认知功能，主要包括词语回忆、物品及手指命名、指令、结构性运用、观念性运用、定向力、言语能力、语言理解、找词困难、记忆再现11项，满分70分，得分越低说明认知功能越好。NPI主要评价患者的精神行为症状，得分越低精神行为症状越好。ADCS-ADL评价患者日常生活能力和社会功能，得分越低说明生活能力越好。

3.4 AD转基因小鼠模型的建立 购自南京大学模式动物研究所的APP/PS1双转基因突变小鼠，取其下一代，同C57BL/6J小鼠杂交，经过PCR方法鉴定，得到具有C57BL/6J 背景的APP/PS1转基因模型小鼠，选择6～8月龄16只，雌雄各半进行实验。

3.5 Morris水迷宫实验 参照Wang等[18]的方法，进行Morris水迷宫(水池直径100 cm,高50 cm；平台直径5 cm,高25 cm)实验，定位航行实验记录小鼠的逃逸潜伏期(从实验开始到小鼠找到平台并在平台上停留时间达到3 s的这段时间)，每只小鼠每天进行4 次实验，每次间隔大于30 min，连续6 d进行定位航行实验；第7天进行空间探索实验(撤去平台)，即将小鼠置于同样的起始点，检测小鼠在60 s内穿越平台位置的次数及在目标象限(平台所在象限位置)停留的时间，用来检测小鼠的记忆能力改变情况。

3.6 免疫组织化学法观察结肠乙酰胆碱转移酶(choline acetyltransferase，ChAT)、VIP、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)、ATP合酶和P2Y受体的表达及分布 参照Li等[19]的方法，即切片脱蜡至水化，3% H2O2阻断内源性过氧化物酶，微波修复抗原后，分别与抗ChAT、VIP、NOS、ATP合酶和P2Y受体的 I 抗4 ℃孵育过夜，滴加 II 抗及辣根酶标记链霉卵白素工作液，DAB显色，棕褐色反应产物代表抗原定位。

3.7 Western blot法检测P2Y的表达 参照Li 等[20]的方法制备蛋白样品，运用BCA蛋白定量法测定蛋白质浓度， SDS-PAGE分离蛋白后转膜，用5%牛奶封闭；经抗体杂交，4 ℃过夜，II 抗37 ℃ 1 h，ECL发光液处理，曝片。内参照用β-actin。目的条带运用软件ImageJ分析蛋白条带灰度值，目的蛋白的相对表达量用目的条带的灰度值与β-actin条带灰度值的比值表示。

3.8 体外器官浴槽观察α，β-亚甲基ATP(α，β-methylene ATP, α，β-MeATP)对自发性结肠平滑肌收缩的影响及Na+通道阻断剂河豚毒素(tetrodotoxin，TTX)对其的效应 实验操作前小鼠禁食12 h，脱颈椎处死，迅速取出近端结肠，置体视显微镜下，剥离结肠肌条[21]。预收缩后进行标本稳定，然后开始实验。

待肌条自发收缩活动平稳后，向浴槽内分别加入 5、10、20、40和100 μmol/L α,β-MeATP，作用20 min，观察肌条收缩情况的变化。选择合适的α, β-MeATP浓度组别，分别加入0.2 μmol/L TTX观察其对α, β-MeATP的效应。实验结束时，选择反应良好的肌条 (用10-4mol/L ACh检测)进行统计。加药前5 min作对照，加药后15～20 min内平滑肌收缩活动(SMUP-E4生物电信号处理系统记录)平均振幅的变化作为加药组的结果。

3.9 体外器官浴槽观察α，β-MeATP对电刺激诱导的结肠平滑肌收缩的影响 结肠肌条制备同上，电刺激诱导结肠平滑肌收缩实验参照林旭红等[22]的方法，向浴槽内分别加入 5、10、20、40和100 μmol/L α,β-MeATP，平滑肌收缩变化用Spike 软件记录连续3次电刺激诱导收缩的均值，结果表示为加药后15～20 min内平滑肌收缩活动平均振幅的变化。

3.10 细胞内微电极技术观察α，β-MeATP对各组结肠平滑肌膜电位(membrane potential，Em)的影响 同上方法在体视显微镜下制备结肠平滑肌肌条，将肌条环形肌面朝上固定于硅胶板上，置于组织浴槽底部(宽8 mm，深8 mm，长20 mm), 在37 ℃充以氧气和二氧化碳的Kreb’s液中孵育，以2 mL/min的速度持续灌流，稳定2 h。根据课题组既往采用传统的细胞内微电极技术法记录平滑肌细胞细胞内Em[22]。获得小鼠结肠平滑肌细胞基础Em活动后，在灌流液中加入5、10、20、40和100 μmol/L α,β-MeATP，观测其对Em活动的影响。

4 统计学处理

应用SPSS 13.0 统计分析软件，各组数据以均数±标准误(mean±SEM)表示，采用独立样本t检验和单因素方差分析的方法进行统计学分析，单因素方差分析后的两两比较采用SNK-q检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 AD患者血浆MTL、CCK、VIP、NO和ATP水平

如图1所示，正常对照组血浆MTL、CCK、VIP、NO和ATP水平分别为(329.07±59.60) ng/L、(5.66±1.02) pmol/L、(22.39±5.83) ng/L、(25.01±3.93) μmol/L和(0.51±0.18) mmol/L，AD患者分别降低至(101.62±28.97) ng/L和(1.21±0.37) pmol/L,升高至(28.61±7.36) ng/L、(47.62±8.29) μmol/L和(5.23±1.32) mmol/L，与对照组比较，除VIP外，其它各项差异均具有统计学显著性(P<0.05或P<0.01)。

2 AD患者神经心理学检查的变化

对照组的MMSE、ADAS-Cog、NPI和ADL评分分别为27.40±10.50、13.10±3.50、6.80±1.30和5.40±1.40，AD患者分别为18.60±7.90、51.30±16.80、26.70±12.10和28.60±12.90，与对照组比较，差异均有统计学显著性(P<0.05或P<0.01)，见表1。

Figure 1.The plasma levels of motilin, CCK, VIP, NO and ATP in the patients with AD measured by radioimmunoassay. Mean±SEM.n=20.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

图1 AD患者血浆motilin、CCK、VIP、NO和ATP水平的变化

表1 各组MMSE、ADAS-Cog、NPI和ADCS-ADL评分情况的比较

*P<0.05,**P<0.01vscontrol.

3 各组小鼠学习记忆力的变化

为了观察各组小鼠认知能力的情况，我们进行了Morris 水迷宫实验，结果如图2所示，经过前5天的学习，观察第6天水迷宫轨迹图发现，正常对照组小鼠找到平台的路程最短，AD组探寻平台的轨迹复杂化；在前6天的定位航行试验中，前3天的定位航行实验各组小鼠逃逸潜伏期比较长且差异没有统计学显著性。从第4天起，AD 组比正常对照组小鼠用时延长(P<0.05)；比较撤去平台观察各组小鼠第7天的空间探索能力发现，AD组比对照组小鼠游经原平台所在象限的次数减少，其差异有统计学意义(P<0.05)。

Figure 2.The changes of learning and memory ability in the AD mice. The escape latency and the number of crossing platform were tested by Morris maze experiment in water. The escape latency was estimated by the time since the mice into water to finding the platform and stopping there over 3 s. The experiment was taken for 6 d. In the first 3 d, the time between control group and AD group had no difference. After 4 d, the escape latency of the AD mice was longer than that in the normal mice. On the 7th day, crossing platform experiment was taken, and the number of the AD mice was significantly less than that of the normal mice. The AD mice wereAPP/PS1 mutant mice aged 6～8 months. Mean±SEM.n=16.*P<0.05vscontrol group.

图2 AD小鼠学习和记忆能力的变化

4 各组小鼠血浆MTL、CCK、VIP、NO和ATP水平的变化

正常小鼠血浆的MTL、CCK、VIP、NO和ATP水平分别为(196.05±63.60) ng/L、(3.18±0.92) pmol/L、(15.21±5.79) ng/L、(18.03±4.62) μmol/L和(0.29±0.20) mmol/L，AD小鼠分别降低至(91.65±34.93) ng/L、(0.21±0.08) pmol/L和(13.66±7.28) ng/L，升高至(35.74±9.35) μmol/L和(4.67±1.58) mmol/L，与对照组比较，除VIP外，其它各项差异均具有统计学显著性(P<0.05或P<0.01)，见图3。

Figure 3.The plasma levels of motilin, CCK, VIP, NO and ATP in the mice. The AD mice wereAPP/PS1 mutant mice aged 6～8 months. Mean±SEM.n=16.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

图3 小鼠血浆motilin、CCK、VIP、NO和ATP水平的变化

5 各组小鼠结肠组织ChAT、VIP、NOS和ATP合酶的表达

免疫组化结果显示，与对照组比较，AD小鼠的ATP合酶在结肠表达明显上调(P<0.05)，而ChAT、VIP和NOS表达无明显改变，见图4。

6 各组小鼠结肠组织P2Y受体的表达

免疫组化结果显示，AD小鼠P2Y受体表达水平较对照组明显上调，阳性染色主要位于神经纤维分布区域，Western blot实验结果也表明P2Y受体表达明显上调(P<0.01)，见图5。

7 α,β-MeATP对小鼠自发性结肠平滑肌收缩的影响

体外实验发现，正常小鼠结肠平滑肌呈节律一致性自发性收缩，约每分钟30次，5 μmol/L和10 μmol/L的α,β-MeATP对这种收缩无明显影响，从20 μmol/L起，α,β-MeATP可浓度依赖性抑制正常小鼠结肠平滑肌自发性收缩(P<0.05或P<0.01)，且这种抑制作用可被Na+通道阻断剂TTX逆转(P<0.05)。α,β-MeATP对AD小鼠自发收缩也具有明显的抑制作用(P<0.01)，其抑制作用也能被TTX拮抗(P<0.05或P<0.01)。α,β-MeATP在100 μmol/L时对AD小鼠自发性收缩的抑制作用更明显(P<0.05)，AD小鼠与正常小鼠比较，TTX对100 μmol/L α,β-MeATP的拮抗作用差异也有统计学显著性(P<0.05)，见图6。

8 α,β-MeATP对小鼠电刺激诱导的结肠平滑肌收缩的影响

电刺激引起小鼠回肠规律性的相位性收缩，随着刺激频率的增高，收缩振幅逐渐升高，10～20 Hz刺激时变化最明显，至50 Hz时达到最大收缩[19]，我们选用10 Hz作为后续研究的基础。实验发现20 μmol/L、40 μmol/L和100 μmol/L的α,β-MeATP明显降低电刺激诱导的结肠收缩，AD小鼠和正常小鼠中差异均具有统计学显著性(P<0.05或P<0.01)。40 μmol/L和100 μmol/L α,β-MeATP对AD小鼠的抑制作用比正常小鼠更明显(P<0.05或P<0.01)，见图7。

Figure 4.The expression of ChAT, VIP, NOS and ATP synthase in the mouse colonic smooth muscles detected by the method of immunohistochemistry. The brown granules indicate positive staining. Mean±SEM.n=16.*P<0.05vscontrol group.

图4 小鼠结肠平滑肌组织中ChAT、VIP、NOS和ATP合酶的表达

9 α,β-MeATP对小鼠结肠平滑肌Em的影响

如图8所示，各浓度的α,β-MeATP对小鼠结肠平滑肌细胞的Em无明显影响。

讨 论

越来越多的证据表明，AD是一种影响多系统的疾病，除累及中枢神经系统外，还牵涉其它多个系统[23]，其中，胃肠道的生理改变和临床意义得到越来越多的关注。已有临床研究发现[24]，与对照组相比，PD患者存在更多的排便障碍，而严重的便秘与疾病确诊时间和严重程度有关。临床发现，AD患者也存在严重的便秘，并受诸多危险因素的影响，是便秘的高发人群[25]。动物实验也表明，AD模型小鼠结肠运动功能有改变[26]。为了进一步研究AD患者是否存在结肠运动功能障碍及机制，本课题选取20例AD患者和20例健康人，通过检测其血浆中MTL、CCK、VIP、NO和ATP水平，来评价结肠运动功能；另外通过神经心理学相关评分，来检测AD患者的神经心理学的情况。本实验发现，与对照组相比，AD患者神经心理学普遍存在变化，同时血浆中促进胃肠运动的激素MTL和CCK水平降低，抑制胃肠运动的激素NO和ATP水平升高，提示患者可能存在胃肠运动功能障碍。

Figure 5.The expression of P2Y receptor in the mouse colonic tissues detected by the methods of immunohistochemi-stry (A) and Western blot (B). Mean±SEM.n=16.*P< 0.05,**P<0.01vscontrol group.

图5 小鼠结肠组织P2Y的表达

Figure 6.The effect of α,β-MeATP on the spontaneous contraction of colon smooth muscle in the mice. A: the raw traces of normal mice; B: the raw traces of AD mice; C: the statistical profiling of spontaneous contraction of muscle strip in normal mice; D: the statistical profiling of spontaneous contraction of muscle in AD mice; E: the comparison of the muscle spontaneous contraction between normal mice and AD mice. Mean±SEM.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group (without treatment);#P<0.05,##P<0.01vsthe same dose of α,β-MeATP;$P<0.05vsα,β-MeATP (normal);&P<0.05vsα,β-MeATP+TTX (normal).

图6 α,β-MeATP对小鼠自发性结肠平滑肌收缩的影响

为证实这一假设，我们利用AD模型小鼠进行动物实验，即APP/PS1双转基因的下一代与C57BL/6J小鼠杂交得到的AD模型小鼠。APP/PS1双转基因小鼠是2个基因的融合体，即突变的人鼠淀粉样前体蛋白APPswe和人类早老素ΔE9基因，它们的启动都是由小鼠朊病毒蛋白启动子操纵的。APP/PS1双转基因的小鼠存在人类早老素基因的第9个外显子的缺失，以及ΔE9的突变，从而出现早发性老年痴呆。此APP/PS1双转基因的小鼠内源性蛋白被人类早老素蛋白所代替，并且在脑匀浆中还检测到了人源淀粉样前蛋白，同时实验中还发现6～7月龄的小鼠脑内即形成β淀粉状蛋白沉淀，这比实验室之前应用的Tg2576转基因AD小鼠特征更加明显，因此选用APP/PS1双转基因进行实验操作。在水迷宫实验中，AD小鼠学习记忆力出现明显变化，主要表现为逃逸潜伏期比正常对照组小鼠用时延长，空间探索能力方面，也比对照组小鼠游经原平台所在象限的次数减少；同时AD小鼠胃肠运动激素也经历了AD患者同样的变化，也表现为血浆中促进胃肠运动的激素MTL和CCK水平降低，抑制胃肠运动的激素NO和ATP水平升高，同时进一步检测结肠组织中ENS系统的变化，发现AD模型小鼠结肠组织整体ENS数量明显增加，其中胆碱能神经和肾上腺素能神经无明显变化，NO及VIP抑制性非肾上腺能非胆碱能(non-adrenergic non-cholinergic，NANC)神经元也无明显变化，而ATP嘌呤能神经元有所增加，这与血浆ATP水平升高结果一致，表明ATP嘌呤能神经信号可能在AD伴发的胃肠运动障碍中起重要作用。

为进一步探讨ATP嘌呤能信号在AD发病中的作用及其机制，我们测定了与AD及胃肠道关系均密切的P2Y受体，与正常对照小鼠比较，发现在蛋白水平，AD小鼠结肠表达P2Y受体水平明显上调，提示P2Y受体可能是ATP发挥作用的关键因素；另外利用ATP的模拟物α，β-MeATP进行体外实验，表明α，β-MeATP浓度依赖性抑制小鼠结肠平滑肌自发性收缩，且这种抑制作用能被TTX阻断，提示其作用位点在ENS，而这些效应在AD小鼠更明显，这与AD小鼠体内实验结果一致，说明嘌呤能信号在改变AD小鼠结肠平滑肌收缩活性及结肠运动功能障碍中起重要作用。

Figure 7.The effect of α,β-MeATP on the contraction of colon smooth muscle induced by electrical stimulation in the mice. A: the raw traces of normal mice; B: the raw traces of AD mice; C: the statistical profiling of contraction of muscle strip after 10 Hz electrical stimulation in normal mice; D: the statistical profiling of contraction of muscle after 10 Hz electrical stimulation in AD mice; E: the comparison of muscle contraction in normal mice and AD mice. Mean±SEM.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group；#P<0.05,##P<0.01vsnormal mice.

图7 α,β-MeATP对小鼠电刺激诱导的结肠平滑肌收缩的影响

Figure 8.The effect of α,β-MeATP on the membrane potential of colon smooth muscle. A: the raw traces of membrane potential in the colon smooth muscle; B: the effect of α，β-MeATP on the membrane potential in mice. Mean±SEM.n=6.

图8 α,β-MeATP对小鼠结肠平滑肌膜电位的影响

胃肠道平滑肌细胞Em是影响平滑肌反应性、进而改变其舒缩活动的主要因素，为了进一步明确α，β-MeATP对小鼠结肠运动的作用机制，我们观察了其对小鼠结肠平滑肌细胞Em的影响，发现α，β-MeATP不改变AD小鼠平滑肌细胞Em，提示ATP嘌呤能信号对结肠平滑肌的舒张作用并不是通过改变Em实现的。

综上所述，AD患者和AD小鼠血浆中促进胃肠运动的激素MTL和CCK水平降低，抑制胃肠运动的激素NO水平升高，胃肠总体运动功能被抑制；AD小鼠血浆ATP水平升高，同时ATP嘌呤能神经元增加，P2Y受体表达上调；在AD发病中，ATP介导的嘌呤能信号可能通过抑制结肠平滑肌收缩，从而导致结肠运动功能障碍。

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(责任编辑： 卢 萍， 罗 森)

Role of purinergic signaling mediated by ATP in Alzheimer’s disease-associated colonic motility disorder

LIN Xu-hong1, WANG Hui-chao2, GUO Jun-ling3,4, FANG Xiao-peng1, ZHANG Jun-shi5, GUO Jun-nan5, LI Yu-xia1, YANG Rui-lin1, LI Tie-jun2, LIU Jian-lin2

(1DepartmentofClinicalLaboratory,TranslationalMedicalCenter,HuaiheHospital,2DepartmentofNephrology,TheFirstAffiliatedHospital,3DepartmentofClinicalCardiology,HuaiheHospital,4SchoolofMedicine,5DepartmentofNeurology,HuaiheHospital,HenanUniversity,Kaifeng475000,China.E-mail:uhchao@163.com)

AIM: To explore the role of purinergic signaling mediated by ATP in the Alzheimer’s disease (AD)-related colon motility disorder and its related molecular mechanisms.METHODS: (1)Clinical trials: AD patients in our hospital were collected and studied. Radioimmunoassay was used for the determination of plasma motilin (MTL), cholecystokinin (CCK), vasoactive intestinal peptide (VIP) and nitric oxide (NO), and high-performance liquid chromatography (HPLC) was applied to test the level of adenosine triphosphate (ATP). The patients were assessed by neuropsychology and scored accordingly. (2)In animal experiments, AD mice received Morris water maze test, and the spatial learning and memory function were evaluated. The plasma levels of MTL, CCK, VIP and NO were examined by radioimmunoassay, and the level of ATP was measured by HPLC. Choline acetyltransferase (ChAT), VIP, nitric oxide synthase (NOS) and ATP synthase were detected by immunohistochemistry. Western blot and immunohistochemistry were used to detect the expression of P2Y receptor. (3)Invitro, organ bath was applied to observe the effect of α,β-methylene ATP (α,β-MeATP), an agonist of P2Y receptor, on both spontaneous and electrically evoked contraction of colonic smooth muscle strip, and the technique of intracellular microelectrode was applied to observe the effect of α,β-MeATP on the membrane potential of colonic smooth muscle cells.RESULTS: Compared with control group, the levels of MTL and CCK were decreased (P<0.01), and the levels of NO and ATP were increased (P<0.05 orP<0.01), while the VIP level was not changed. Mini-Mental State Examination (MMSE) score was decreased (P<0.05), Alzheimer’s Disease Assessment Scale-Cognitive Subscale (ADAS-Cog) score, Neuropsychiatric Inventory (NPI) score and Alzheimer’s Disease Cooperative Study-Activities of Daily Living Scale (ADCS-ADL) were all increased as compared with control group (P<0.01). The 4～6 d escape latency ofAPP/PS1 AD mice was significantly prolonged (P<0.05), and the space exploration ability distinctly reduced (P<0.05). In AD mice, the levels of MTL and CCK were decreased (P<0.01), and the levels of NO and ATP were increased (P<0.05 orP<0.01), while the VIP level was not changed. The protein expression of colonic ATP synthase was significantly increased (P<0.05), but the expression of ChAT, VIP and NOS was not changed. The expression of P2Y receptor was increased (P<0.01). The results ofinvitroexperiment displayed that α,β-MeATP, from 20 μmol/L to 100 μmol/L, inhibited the spontaneous contraction of colonic smooth muscle strip in the normal mice and AD mice (P<0.05 orP<0.01), and this inhibition was reversed by Na+channel inhibitor tetrodotoxin (TTX) (P<0.05 orP<0.01). In addition, the effect of α,β-MeATP at 100 μmol/L on the AD mice was more obvious than that on the normal mice (P<0.05), and this inhibition was also antagonized by TTX (P<0.05 orP<0.01), pro-minent in AD group as compared with control group (P<0.05). In 10 Hz electrically evoked contraction of colonic smooth muscle strip, α,β-MeATP inhibited both the normal and AD mice (P<0.05 orP<0.01), while the inhibition was more obvious in the AD mice at the concentration of 40 μmol/L or 100 μmol/L (P<0.05 orP<0.01). CONCLUSION: AD patients and AD mice are accompanied by decreased MTL and CCK levels, and enhanced NO level, thus inducing colonic motor dysfunction along with AD. Meanwhile, ATP in plasma, purinergic neurons, and P2Y receptor expression are increased in the AD mice. Purinergic signaling mediated by ATP inhibits colonic smooth muscle strip contraction and further paralyzes the colonic movement function in AD.

P2Y receptor; Alzheimer’s disease; Enteric nervous system; Colonic motility disorder

1000- 4718(2016)12- 2113- 12

2016- 08- 15

2016- 09- 27

国家自然科学基金资助项目 (No.U1304802； No.81500430)

R363； R749.1+6

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.12.001

杂志网址： http://www.cjpp.net

△通讯作者 Tel: 0371-22736820； E-mail: uhchao@163.com