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(南华大学附属第一医院检验科，湖南 衡阳 421001)

·文献综述·

PCR技术在梅毒检测中的应用

朱雅玲，刘双全*

(南华大学附属第一医院检验科，湖南 衡阳 421001)

梅毒是一种由梅毒螺旋体(TP)感染引起的慢性性传播疾病，其临床表现复杂多样。目前常用实验室诊断方法主要有暗视野显微镜法和血清学方法。近年来，聚合酶链式反应(PCR)技术在梅毒实验室诊断中得以应用，在早期梅毒以及特殊梅毒的诊断中显示出灵敏度高、特异性较强、稳定性好等优点。本文就PCR检测技术在梅毒实验室诊断中的研究进展予以综述。

梅毒； 梅毒螺旋体； 聚合酶链式反应； 实验室诊断

梅毒是一种由梅毒螺旋体(Treponemapallidum，TP)感染所引起的慢性、全身性的性传播疾病。梅毒早期表现为皮肤黏膜溃疡和皮疹，晚期表现为一系列包括心血管和神经系统疾病的严重并发症[1]。梅毒在一期和二期的传染性最强，因此早期诊断能有效防止梅毒传播[1]。由于TP尚不能进行体外培养，目前梅毒的实验室诊断，主要用直接病原体检查和梅毒血清学方法[2]。直接病原体检查如暗视野显微镜(Dark field microscope，DFM)的结果很大程度受实验室技术人员专业经验的影响；而一期梅毒、胎传梅毒以及神经梅毒通过常规血清学方法检测的特异性和灵敏性偏低，常出现假阴性，因而需要对患者反复进行检测，这可能导致治疗的延误，增加发生并发症的可能性以及潜在的传染性。近年来，随着TP全基因组的解析，PCR技术在梅毒实验室诊断过程中得到应用，尤其一期梅毒、先天性梅毒和神经梅毒的诊断中体现出较好的应用价值[2]，特别是在低病原体水平以致不足以诱导产生特异性IgM和(或)IgG的情况下[3]。现就PCR检测技术在梅毒实验室诊断中的现状进行综述。

1 PCR检测技术类型

美国疾病控制与预防中心(CDC)最近重新确定了一期和二期梅毒的定义，并指出在继基准测试DFM方法之后，PCR被认为是诊断梅毒常用的高度特异、敏感的分子生物学方法，可用于检测早期梅毒各临床样品中微量TP及对不同TP临床株进行基因分型[4]。目前实验室诊断梅毒常见的PCR技术主要有巢式PCR、实时荧光定量PCR(Real time fluorescence quantitative PCR，RTFQ-PCR)和逆转录-PCR(Reverse transcription-PCR，RT-PCR)等。检测标本包括血(血清、全血)、羊水、脑脊液、皮损材料(分泌物、组织)等。检测的目标基因包括TP47、TmPA、TmPB、4D等表面脂蛋白以及polA等参与基因组复制酶的编码基因[5]。见表1。

1.1常规PCR 常规PCR法与TPPA、暗视野镜检等方法相比，虽然其特异性和敏感性有所提高，但在检测TP含量低且含有难去除的Taq酶抑制因子的血、脑脊液等标本时，其敏感性仍较低[6]，且由于其操作繁琐，近年已很少用于临床梅毒检测。

1.2巢式PCR 巢式PCR是一种应用两对特异性引物的PCR技术。第一对PCR引物扩增片段和常规PCR相似，第二对引物以第一次PCR产物为模板进行扩增，因此巢式PCR较于常规PCR敏感性得到极大提升，推荐用于诊断临床表现不明显或者血清学诊断为阴性的可疑梅毒、暗视野显微镜检查为阴性的一期梅毒，以及包括伴有艾滋病的梅毒、神经梅毒等特殊梅毒。此外，巢式PCR对判断梅毒患者血液的传染性、判定疾病治疗效果、研究梅毒的发病机制以及完善流行病学也具有重要的意义，还能用于筛选假阴性样本。

雷震山等[7]根据TP47基因设计巢式PCR引物，检测一期梅毒患者195例硬下疳分泌物以及血液标本，同时与TRUST和TP-ELISA血清学方法以及暗视野镜检对比，发现相较于显微镜检查和TP-ELISA，巢式PCR的灵敏度和特异性均更高，表明在早期梅毒诊断中，巢式PCR与血清学检测以及暗视野镜检相结合，可以有效减少漏检，更有利于梅毒的早诊断早治疗。

表1TPPCRDNA扩增引物

DNA靶引物对引物名序列5'～3'产物长度TP471TP471TCATCATGAGACGCACTATC308bpTP472CACGCACCATCTTAGTAACG2TP473GACAATGCTCACTGAGGATAGT658bpTP474ACGCACAGAACCGAATTCCTTG3TP475AGTAACGCTTGGGTCAGTCTCG122bpTP476CGTTCCGTCAGCAATTTCAGTA4TP477AGGGGAAGGTGCTGACCATAG146bpTP478GGGAGTGAAATCCGCAGAGAGTP479(探针)(6-FAM)AGCCTAAGCTTGTCAGCGATCAAGC(BHQ1)5TP4710CGAGGAATACAAGATTACGAACG178bpTP4711ACGTGCAGAAAAACTATCCTCAGpolA6polA1GGTGAACTCCGGTATTGAA200bppolA2CATCCGTTTCACAATCAAApolA3(探针)FAM-AG-TAACACCACGATAATGACCTGC-MGBTmPA7PHT1GCAGTGTCTGCAATCCACCGT599bpPHT2CGAGAAATTACGTGTCGTCAT4D8PHD1TGTACCGGACGCTCGTGCCATT428bpPHD2TTGGCCTTTCCCAACGTCCTCAG

1.3半巢式PCR 巢式PCR与普通PCR相比虽有很大进步，但仍有操作较繁琐、成本相对较高等缺点，因此又发展出半巢式PCR。半巢式PCR是在第二次扩增时只增加一条引物进行扩增，在巢式PCR优点的基础上有操作简化、成本较低等特点。

周潇等[8]以TP polA基因，取已诊断为一期梅毒的60例患者的溃疡面组织液做半巢式PCR，同时取全部患者的血液标本做半巢式PCR和TPPA，显示半巢式PCR检测一期梅毒有很好的特异性；从敏感性来看，检测早期梅毒组织液标本半巢式PCR比TPPA敏感性高，检测早期梅毒血液标本时则是TPPA更高；而半巢式PCR检测早期梅毒组织液标本比血液标本敏感性高，以上提示：一期梅毒的半巢式PCR在以组织液为标本时具有高特异性和敏感性，而以血液为标本时敏感性较低，因此，取组织液进行半巢式PCR检测TP更有应用价值，而用血液进行检测则推荐进行TPPA检测。

1.4实时荧光定量PCR(RTFQ-PCR) RTFQ-PCR是将荧光标记探针加入到普通PCR反应体系中，利用荧光信号的出现及其积累强度对PCR全进程进行实时监测，利用得出的标准曲线对未知模板进行定量分析，较之普通PCR方法，RTFQ-PCR技术具有稳定性高、特异性强、灵敏度高的特点，是目前梅毒诊断的主要分子生物学方法。

Tipple C等[9]建立基于TP47基因的FQ-PCR，对99例梅毒患者的溃疡和血液标本(包括一、二期梅毒、早期潜伏梅毒、神经梅毒以及阴性血清)进行定量检测，结果显示，FQ-PCR在一期梅毒取溃疡标本和全血标本相比较，两者特异性都很高，但灵敏度上溃疡标本明显高于全血标本，而在二期梅毒中两种标本的灵敏度和特异性无显著差异；FQ-PCR可以对临床标本中的TP进行定量测试，并提供梅毒感染的动力学结果；在梅毒不同阶段的溃疡和血液中所发现的TP数量是遵循生物学合理模式；FQ-PCR方法检测溃疡中若存在大量TP则可能表示HIV-1阳性患者更容易传播梅毒。

王莹等[10]构建了基于TP47基因的FQ-PCR方法，并对其检测TP的特异性、灵敏度进行了评测。以PMD18-T-TP47质粒做为阳性对照，通过对大肠杆菌等基因组DNA进行提取及FQ-PCR扩增，扩增结果均为阴性；同时对梅毒螺旋体TP47基因同源性进行对比，发现TP47基因序列以99%的相似度仅保守存在于不同梅毒螺旋体菌株中，提示基于TP47基因的FQ-PCR法有很高特异性。通过以不同浓度的重组质粒PMD18-T-TP47为模板进行QF-PCR检测来评价该方法的敏感性，结果显示以10个/mL的质粒浓度为模板时检测结果为阳性，提示该方法具有较高灵敏度。通过对20份临床分离TP进行FQ-PCR检测，其结果均为阳性，与血清学检测结果一致，提示该方法适用于临床标本检测。

赵丹等[11]建立基于TP特异性外膜蛋白Gpd基因的TP重组质粒标准品和其二聚体蝎型探针定量PCR，该新型FQ-PCR检测22例确诊病例均为阳性，检测8例健康体检者均为阴性，其灵敏性、特异性、阳性预测值皆为100%；与以Taqman为探针的FQ-PCR同时检测40例疑似梅毒患者血清标本，新型FQ-PCR的阳性检出率为82.5%，明显高于以Taqman为探针的FQ-PCR。以上可知，二聚体蝎型探针定量PCR具有很高灵敏性和特异性，其更有利于临床梅毒的早期诊断。

郭文秀[12]等基于polA基因序列建立FQ-PCR法，检测不同国家和人种TPPA抗体阳性和阴性患者的血液，对新建的FQ-PCR的特异性和灵敏度以及这两种方法结果的符合率做相关评析，其试验结果显示该新建FQ-PCR有很高的特异性和灵敏度，可用于排除非现行感染梅毒但TPPA法阳性的患者，提高了对不同国家、种族的旅行者的梅毒诊断的正确性。

Cornut PL等[13]研究FQ-PCR对诊断房水中的TP的临床价值，对确诊有眼部梅毒的患者的房水进行FQ-PCR检测polA基因，认为该方法检测房水能确认梅毒性葡萄膜炎。

杨梅[14]比较FQ-PCR法和免疫印迹法对新生儿梅毒的诊断，结果显示FQ-PCR敏感性和特异性分别为98%和100%，明显高于免疫印迹法的84%和85%，认为在诊断新生儿先天梅毒中，FQ-PCR优于免疫印迹法，值得在临床中推广。

Kai-Hua Chi[15]等开发了基于TaqMan探针的实时荧光多重PCR法，以TP0858为目的基因，它能在单个检测中同时且快速地对苍白密螺旋体的苍白亚种(梅毒病原体)、地方亚种(地方性梅毒病原体)和极细亚种(雅司病原体)进行区分，可用于对个例的筛查和研究，尤其对雅司病的诊断有很高的特异性和灵敏度。

以上研究表明，FQ-PCR法对于一期梅毒及新生儿天生梅毒的检测具有特异性高、灵敏度强、快速高效的优点。对于无临床症状的潜伏梅毒，由于不能通过显微镜法得出诊断，而其所依赖的血清学方法也因感染时间增长而敏感性降低常不能有效作出诊断[16]，应用FQ-PCR法对溃疡标本进行检测则能有效检出TP，并且能对TP进行定量分析，有利于临床对潜伏梅毒等特殊梅毒的诊断与分析。FQ-PCR更能用于检测TP分子分化亚种，其结合经典血清学方法对确定全球TP亚型地理分布以及对特有TP的根除有重要的作用[15]。

1.5圆盘式超快速荧光定量PCR 张慧嫦等[17]为减短诊断梅毒时荧光定量PCR反应时间，提高其反应效率，以FQ-PCR为基础设计发明了新型圆盘式超高速实时荧光定量PCR仪，以TP17特异基因为靶序列设计引物探针，建立了圆盘式超快速荧光定量PCR方法来检测TP，以新建荧光定量PCR法和普通荧光定量PCR法对36份TRUST、TPPA均阳性的血清标本进行检测对比。显示圆盘式超快速荧光定量PCR方法特异性100%，其精密度较高，阳性和阴性质控品在不同时间测试3次以及同时间5次重复实验结果CV均<5%，因此可认为该方法在梅毒快速诊断上有一定的应用前景，其对判断血液中TP增殖能力具有很大的潜在价值。

1.6多重PCR 多重PCR是在同一个反应管中用多对引物同时扩增几条DNA片段，常用于与其他病原体同时检测。Palmer[18]等通过对98例有溃疡的梅毒患者进行血清学检测和以TP47为目的基因的多重PCR检测作对比分析，多重PCR检测原发性梅毒的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为94.7%、94.7%、98.6%和98.6%，对二次梅毒的诊断则分别为80%、98.6%、88.9%和97.2%，显示多重PCR法是一种敏感、特异的梅毒检验方法，可作为显微镜法级TPPA法的重要辅助诊断方法。但由于多重PCR法同时扩增的DNA片段越多，操作则越繁琐，在很多现实条件的限制下，近年来多重PCR已很少应用在梅毒临床检测中。

1.7逆转录-PCR 逆转录PCR是提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA；再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。逆转录PCR的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的RNA。用于逆转录PCR设计引物的靶基因是16srRNA，它需要Southern印迹杂交试验来保证其特异性，因此，操作比较繁琐，近年来临床上已很少使用。

2 结 语

综上所述，PCR方法在梅毒早期诊断以及特殊梅毒诊断中，具有高特异性、高灵敏度和稳定且快速的优点，具有较好的临床应用前景。随着全球梅毒发病率的不断提高[19-21]，梅毒对公共卫生的影响已经越来越严重。如能将PCR法与血清学方法、暗视野显微镜法相结合，相信会更有利于早期梅毒以及特殊梅毒的诊断以及治疗。

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10.15972/j.cnki.43-1509/r.2016.06.024

2016-01-01；

2016-06-15

国家自然科学基金(81201331).

*通讯作者，E-mail:littletwod@outlook.com.

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