朱美婵周枫王蒙林颖王兴君于锋王海涛黄利芬梁子健

广东省59例大前庭水管综合征患者SLC26A4基因突变及表型分析*

朱美婵1周枫1王蒙1林颖1王兴君1于锋1王海涛1黄利芬1梁子健1

目的 探讨广东省大前庭水管综合征（enlargement of vestibular aqueduct syndrome，EVAS）患者SLC26A4基因位点突变及相关听力表型，为研究EVAS发病机制提供参考。方法 采用基因芯片法对59例EVAS患儿进行SLC26A4基因IVS7－2A＞G：2168A＞G位点检测，并行颞骨CT影像学检查。结果 59例EVAS患者中21例（35.59%）为SLC26A4双等位基因（纯合或复合杂合）突变，其中16例为IVS7－2A＞G纯合突变，2例为2168A＞G纯合突变，3例为IVS7－2A＞G、2168A＞G复合杂合突变，这21例CT均显示为双侧前庭水管扩大或其他内耳畸形；38例为SLC26A4单等位基因突变，其中31例为IVS7－2A＞G杂合突变，7例为2168A＞G杂合突变，这38例中4例为前庭水管扩大伴Mondini畸形，2例表型正常，其余均为双侧前庭水管扩大。59例患儿均表现为重度－极重度聋。结论 本组EVAS患者中SLC26A4基因IVS7－2A＞G位点的突变发生率最高，其次为2168A＞G；均表现为双耳重度或极重度感音神经性听力损失。

SLC26A4基因； 大前庭水管综合征； 内耳畸形； 表型

SLC26A4基因突变导致的大前庭水管综合征（enlargement of vestibular aqueduct syndrome，EVAS）是引起感音神经聋的常见遗传学病因之一［1］，而大前庭导水管综合征以前庭水管扩大伴感音神经性听力损失为主要特征，是遗传性聋的第2大病因［2］，该疾病表现为隐性遗传，主要致病基因为SLC26A4［3］。研究表明，SLC26A4基因突变在不同地域和民族中具有迥异的基因图谱，在欧美EVAS患者中，50%不能发现SLC26A4基因突变［4，5］，但中国EVAS患者SLC26A4基因突变发生率明显高于西方人群［6］。本研究拟通过DNA分子检测手段，对广东地区59例EVAS患者进行SLC26A4基因突变位点分析，以明确该地区EVAS患者中SLC26A4基因突变的高发位点，为EVAS耳聋的早期发现、诊断和防治提供参考。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取广东地区（包括广州、中山、肇庆、珠海等地）聋校及语训中心感音神经性听力损失（SNHL）患者507例，男281例，女226例，年龄7～18岁，中位数年龄为13岁，已剔除全身器质性疾病或合并其他遗传疾病。

1.2 研究方法

1.2.1 病史资料采集 由学生家长填写遗传性聋基因检测登记表，以获取耳聋的相关信息，包括患者的一般信息、家族史、个人史（遗传性疾病史、耳毒性药物应用情况、头部外伤史等）、耳聋发病年龄、患者母孕期情况等。对受检者进行详细的病史调查及体格检查，以排除其他致病因素和综合征型聋。

1.2.2 DNA提取 患者在签署知情同意书后，抽取外周静脉血2 ml，3.2%柠檬酸钠抗凝，无菌4℃保存待检。采用天根生化科技有限公司生产的血液基因组DNA提取系统（非离心柱型）（货号：DT319－02），晶芯Bio Mix－er TMII芯片杂交仪、晶芯SlideWasher TM芯片洗干仪、晶芯LuxScan TM10K－B微阵列芯片扫描仪由北京博奥生物工程有限公司提供。从所有患者外周血中提取基因组DNA，用紫外分光光度计检测DNA浓度和纯度，其余保存于－70℃冰箱备用。

1.2.3 SLC26A4基因芯片检测方法 通过以人基因组DNA为模板，采用带有Tag标签序列的基因位点特异性引物对相关基因位点所在的基因片段进行扩增和荧光标记，然后与能够识别相应标签序列的通用基因芯片进行杂交。使用LuxS-can TM10K－B微阵列芯片扫描仪和相应的遗传性耳聋基因检测芯片判别系统进行SLC26A4基因IVS7－2A＞G、2168A＞G位点的检测，操作按试剂盒说明书步骤进行。

1.3 颞骨CT扫描及前庭水管扩大诊断标准 被检出SLC26A4基因突变的59例患者均进行高分辨率颞骨CT扫描，前庭水管扩大的诊断标准为：前庭水管外口至半规管总脚中点直径≥1.5 mm。

1.4 听力学检查 被检出的59例患者均进行纯音听阈测试，对于不能很好配合纯音测听的患者给予声导抗和听性脑干反应（ABR）检测，依据欧洲工作组倡导的遗传性聋的分级标准，将听力损失程度分为轻度（20～40 d B HL）、中度（41～70 d B HL）、重度（71～95 dB HL）及极重度（＞95 dB HL）［7］。

1.5 统计学方法 使用SPSS 20.0统计学软件，分别对SLC26A4突变患儿的听力检测结果、发病年龄、前庭水管外口至半规管总脚中点直径进行统计学分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

507例受检的NSHL患者中，59例（11.64%，59／507）携带SLC26A4基因的热点突变，其中，21例（35.59%，21／59）为双等位基因（纯合或复合杂合）突变，其中16例为IVS7－2A＞G纯合突变、2例为2168A＞G纯合突变及3例为IVS7－2A＞G、2168A＞G复合杂合突变，这21例患儿CT结果显示为双侧前庭水管扩大或其他内耳畸形。38例（64.41%，38／59）为单等位基因突变，其中31例为IVS7－2A＞G杂合突变、7例为2168A＞G杂合突变，这38例中4例为前庭水管扩大伴Mondini畸形，2例表型正常，其余均为双侧前庭水管扩大。59例患儿的基因突变及表型见表1。

21例双等位基因突变（纯合或复合杂合，包括IVS7－2A＞G纯合突变，IVS7－2A＞G、2168A＞G复合杂合突变，2168A＞G纯合突变）患者的纯音听阈（94.67±7.21 d B HL）与单等位基因突变（包括IVS7－2A＞G杂合突变、2168A＞G杂合突变）患者的纯音听阈（92.63±14.95 d B HL）差异无统计学意义（P＞0.05）。基因突变检测结果及对应的颞骨高分辨CT扫描结果见图1～8。

表1 59例SLC26A4基因突变患者基因型及相关听力表型（±s）

表1 59例SLC26A4基因突变患者基因型及相关听力表型（±s）

突变分类例数（例，%）检测年龄（岁）发病年龄（岁）前庭水管直径（mm）平均听阈（d B HL）左 右IVS7－2A＞G纯合突变16（27.12）10.50±3.58 1.49±0.90 3.34±0.71 91.88±8.34 95.31±6.70 IVS7－2A＞G、2168A＞G复合杂合突变3（5.08）9.00±1.00 2.67±0.58 3.53±0.094 95.00±4.36 100.33±5.51 IVS7－2A＞G杂合突变31（52.54）12.39±2.77 1.27±1.01 3.38±1.08 93.77±9.87 96.42±7.59 2168A＞G杂合突变7（11.86）14.43±2.23 1.89±1.07 3.01±0.47 85.86±6.36 87.86±6.99 2168A＞G纯合突变2（3.39）9.50±0.71 2.50±0.71 3.20±0.28 97.50±3.54 100.00±0.00

图1 IVS7－2A＞G纯合突变患者的EVAS

图2 IVS7－2A＞G纯合突变患者的前庭和耳蜗畸形

3 讨论

SLC26A4基因突变在大前庭水管患者中的检出率国内外不同，我国为97.9%，日本为92%，韩国为78%，但在高加索地区白种人中只有53%［8～11］。欧美白人中SLC26A4基因突变位点T416P、L236P和IVS8＋1G＞A是Pendrin综合征患者最常见的几种突变类型［12］，亚洲人群IVS7—2A＞G、H723R和L676Q的突变频率较高［6，9，13］；戴朴等［14］发现SLC26A4基因在中国耳聋人群中的独特突变谱，最常见的类型为IVS7－2A＞G。明确不同种族人群中SLC26A4基因不同的突变谱对于耳聋的基因诊断有很大帮助。

图3 IVS7－2A＞G杂合突变患者HRCT显示EVAS＋Mondini畸形耳蜗发育小，周数减少或仅有底周，呈囊状扩大

图4 2168A＞G杂合突变患者的EVAS

图5 2168A＞G杂合突变患者的EVAS＋Mondini畸形

图6 2168A＞G纯合突变患者的EVAS

图7 IVS7－2A＞G、2168A＞G复合杂合突变患者的前庭和耳蜗畸形

图8 IVS7－2A＞G、2168A＞G复合杂合突变患者的EVAS

中国人群中SLC26A4基因热点突变包括IVS7—2A＞G、2168A＞G、1226G＞A、1975G＞C、1229C＞T、1174A＞T、1687_1692ins A、IVS15＋5G＞A、2027T＞A、589G＞A、281C＞A等，上述11种热点突变在大前庭水管综合征患者群体中的等位基因频率高达72.62%，其中IVS7—2A＞G、2168A＞G突变等位基因频率最高［15］。本组59例SLC26A4基因突变患者中突变位点主要集中于IVS7－2 A＞G和2168A＞G，与上述研究相符，可见针对IVS7—2A＞G、2168A＞G进行SLC26A4基因突变筛查可提高筛查效率。

文中结果显示，59例SLC26A4基因突变的患者中检出SLC26A4杂合突变41例（69.49%，41／59）（IVS7－2 A＞G杂合突变，2168 A＞G杂合突变，IVS7－2 A＞G、2168 A＞G复合杂合突变），纯和突变18例（30.51%，18／59）（IVS7－2A＞G纯合突变，2168A＞G纯合突变），杂合突变的检出率高于纯合突变，提示SLC26A4基因在常染色体隐性遗传的同时可能具有部分显性遗传特征，但并非所有SLC26A4基因杂合突变者均发生大前庭水管综合征，因此该基因的显性遗传特征还有待进一步实验证明。

本组有3例为IVS7－2A＞G和2168A＞G复合杂合突变，推测相同基因不同位点的复合杂合突变与相同位点的纯和突变具有相似的致病作用，也可以导致其产物Pendrin蛋白出现结构变化和功能障碍引起耳聋，进一步证实SLC26A4基因具有显性遗传特性的推测。

SLC26A4 IVS7—2A＞G突变是国人最热点的突变，SNHL患者中80%的IVS7—2A＞G单杂合突变可以出现EVAS表型［16］。本组病例中SLC26A4 IVS7—2A＞G单杂合突变31例，这些单杂合突变携带者听力表型特征均为重度－极重度感音神经性聋，但其听力损失是否与SLC26A4基因突变有关，尚待进一步的研究。

SLC26A4基因IVS7－2 A＞G、2168 A＞G单杂合突变携带者不一定会发生SNHL，这部分单杂合突变携带者，如果表型为EVAS和SNHL，推测是多基因遗传或者多种因素作用而发病，其原因：①可能存在导致EVAS表型的其他基因突变，突变可能在内含子的隐蔽剪切位点，或者在启动子区而没有被分析到，例如：更远距离的调控作用、启动子区的转录调控作用、启动子甲基化。近来有研究（梅凌云，2008）证明转录因子基因FOXII参与了EVAS的发病，启动子区域的突变直接影响SLC26A4基因的转录；②可能有其他基因突变具有SLC26A4基因突变类似的功能，还可能存在其他的修饰基因，也会影响听力表型的外显率；③环境因素的影响。还有小部分IVS7—2A＞G单杂合携带者可能只有SNHL的表型，并不伴EVAS，杂合突变也有可能使听力表型发生改变。

婴儿进行CT、MRI检查较为困难，基因诊断可为明确其耳聋病因提供一定的参考，基因诊断可以解释部分重度－极重度感音神经性聋的病因，但是还有一部分患者的病因需要进行更加深入的研究。本研究对广东省聋校非综合征型聋患者SLC26A4基因突变情况进行了初步分析，发现了SLC26A4基因突变集中的位点，为广东地区耳聋患者的基因筛查提供了较好的依据。针对SLC26A4基因的复合、杂合突变对耳聋的致病作用，将通过扩大大前庭水管综合征病例及家系的研究进一步证实，争取进一步发现SLC26A4杂合和复合杂合突变对大前庭水管综合征发病的影响及其可能的分子遗传学机制。

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（2015－12－28收稿）

（本文编辑 李翠娥）

Mutations in SLC26A4 Gene and Relevant Phenotype Analysis in Fifty－nine Cases of Enlargement of Vestibular Aqueduct（EVA）Syndrome Children in Guangdong District

Zhu Meichan，Zhou Feng，Wang Meng，Lin Ying，Wang Xingjun，Yu Feng，Wang Haitao，Huang Lifen，Liang Zijian
［Department of Otorhinolaryngology，Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery Hospital of Guangzhou（Guangzhou No.12 Hospital），Guangzhou，510620，China］

Objective The molecular etiology of hearing impairment in Guangdong District has not been thoroughly investigated.SCL26A4 gene mutation and relevant phenotype were analyzed in this study.Methods The coding exons of SLC26A4 were analyzed in 59 EVA cases.Those SLC26A4 gene mutations patients were examined by temporal bone CT.Results Fifty－nine cases were SLC26A4 mutations deafness patients，and 21 cases（35.59%）and 38 cases（64.41%）patients with SLC26A4 biallelic allele（compound homozygous or heterozygous）and monoallelic gene mutation，including 16 cases of SLC26A4 gene IVS7－2 A＞G homozygous mutations，2 cases of 2168A＞G homozygous mutations and 3 cases of IVS7－2A＞G，2168 A＞G compound heterozygous mutations in children with CT showing bilateral enlarged vestibular aqueduct or other types of inner ear malformations.Thirtyone patients were IVS7－2A＞G heterozygous for SLC26A4 mutation and seven 2168 A＞G heterozygous mutation.Four patients with SLC26A4 gene mutations were confirmed to have enlarged vestibular aqueduct with Mondini dysplasia.Two patients with normal phenotype，and others were enlarged vestibular aqueduct.Conclusion Mutations in the SLC26A4 gene with enlarged vestibular aqueduct patients were frequently found in Guangdong District.IVS7－2A＞G mutations rate were highest，followed by 2168 A＞G.We established the new strategy that detects SLC26A4 mutations prior to the temporal bone CT scan to find enlarged vestibular aqueduct and inner ear malformation patients.

SLC26A4 gene； Enlargement of vestibular aqueduct syndrome； Inner ear malformation； Phenotype

10.3969／j.issn.1006－7299.2016.04.004

时间：2016－6－29 16：12

R764.3

A

1006－7299（2016）04－0335－05

* 广州市科技计划项目（2014Y2－00119）资助

1 广州市耳鼻咽喉头颈外科医院（广州市第十二人民医院），广州医科大学耳鼻咽喉头颈外科研究所，广州市耳鼻咽喉头颈外科医院听力中心，耳鼻咽喉头颈外科（广州 510620）

朱美婵，女，广东人，医师，主要研究方向为耳科临床及听力学。

周枫（Email：zhoufengguangzhou＠163.com）

网络出版地址：http：／／www.cnki.net／kcms／detail／42.1391.R.20160629.1612.040.html