段世宏李勇马建鹂杨小龙郭玉芬

青海省回、藏、土、蒙古族非综合征型聋患者致聋基因SNPscan法检测分析

段世宏1李勇1马建鹂1杨小龙1郭玉芬1

目的 调查GJB2、SLC26A4和mtDNA12Sr RNA基因突变在青海省回、藏、土、蒙古族非综合征型聋患者中的突变谱和突变频率。方法 采集青海省回族（123例）、藏族（44例）、土族（34例）及蒙古族（10例）共211例非综合征型聋患者及180例正常人（对照组，其中回族100例，藏族40例，土族30例，蒙古族10例）的外周静脉血，提取基因组DNA，应用SNPscan法检测GJB2基因2个外显子36个突变位点、SLC26A4基因21个外显子77个突变位点和mtDNAA1555G及mtDNAC1494T突变。结果 211例耳聋患者中，5例土族和1例蒙古族患者携带mtDNAA1555G均质性突变；回族、藏族、土族和蒙古族患者GJB2基因突变检出率分别为11.38%、4.55%、5.88%和10%，各民族间差异无统计学意义（均为P＞0.05）。土族和蒙古族耳聋患者GJB2基因最常见的突变形式为c.235delC，等位基因频率分别为2.94%和5%；回族耳聋患者最常见的突变形式为c.299_300del AT，等位基因频率为4.47%。回族、藏族和土族患者SLC26A4基因突变检出率分别为6.5%、4.55%和2.94%，三个民族间差异无统计学意义（均为P＞0.05）；回族耳聋患者SLC26A4主要突变为c.919－2A＞G，等位基因频率为2.44%；藏族耳聋患者SLC26A4的主要突变为c.1226G＞A，等位基因频率为2.27%。正常对照组除了回族中有1例携带GJB2基因c.235delC杂合突变，1例携带SLC26A4基因c.919－2A＞G中等位基因突变，其余三个民族均未检测出GJB2、SLC26A4基因突变。结论 青海省回、藏、土及蒙古族非综合征型聋患者中10.9%（23／211）是由GJB2、SLC26A4和mtDNA A1555G基因突变导致，GJB2和SLC26A4基因突变在该地区4个少数民族非综合征型聋患者中的致病具有民族特异性。

非综合征型耳聋； 突变； 常见致聋基因； 少数民族

GJB2、SLC26A4和mt DNA12Sr RNA基因突变是导致中国非综合征型聋（nonsyndromic hearing loss，NSHL）最常见的病因［1，2］。目前，常用的耳聋基因筛查方法包括直接测序法、基因芯片法、限制性片段长度多态性聚合酶链式反应和变性高效液相色谱分析等；SNPscan技术具有高准确性、高通量、低成本、高效性和高灵活性的特点，该技术已成功应用于耳聋基因、冠状动脉疾病相关基因及乳腺癌易感基因的研究中［3，4］。青海是一个多民族聚集的省份，有着独特民族特点和地域背景，本研究拟通过应用SNPscan技术对青海省回族、藏族、土族及蒙古族NSHL患者进行GJB2、SLC26A4和mtDNA12Sr RNA基因突变筛查，了解三种基因在四个少数民族NSHL患者中的突变谱和突变频率，为防聋治聋工作提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象 211例NSHL患者来自青海省特殊教育学校、西宁市聋哑学校，其中回族123例，男72例，女51例，年龄6～28岁，平均14.0±4.1岁；藏族44例，男23例，女21例，年龄8～21岁，平均13.4±2.8岁；土族34例，男17例，女17例，年龄1～39岁，平均13.2±4.4岁；蒙古族10例，男6例，女4例，年龄3～20岁，平均12.3±2.7岁。均为双侧中重度以上感音神经性听力损失，排除了外、中耳病变导致的听力损失；按照听力损失的标准分级（WHO－1997）：回族患者中重度听力损失9例，重度听力损失12例，极重度听力损失102例；藏族患者中重度听力损失8例，极重度听力损失36例；土族患者中重度听力损失6例，极重度听力损失28例；蒙古族患者中重度听力损失1例，重度听力损失2例，极重度听力损失7例。同时选取听力正常者190例为正常对照组，其中，回族100例，男55例，女45例，年龄3～25岁，平均13.2±4.1岁；藏族40例，男26例，女14例，年龄5～23岁，平均14.1 ±2.5岁；土族30例，男16例，女14例，年龄3～30岁，平均13±3.2岁；蒙古族10例，男5例，女5例，年龄5～25岁，平均15.5±3.5岁。本研究获得兰州大学第二医院伦理委员会批准。

1.2 研究方法

1.2.1 病史采集 采用问卷调查和询问家长或老师的方式收集耳聋患者的病史资料，包括：一般情况、家族史、耳毒性药物使用史、母孕期病毒感染及用药史、头部外伤史、外耳与中耳疾病史及体格检查（全身及专科检查）等。所有患者家长签署知情同意书，根据研究对象的年龄和配合程度分别采用行纯音测听、声导抗和听性脑干反应（ABR）检查。所有患者和对照组人群均抽取外周静脉血5～10 ml。

1.2.2 基因组DNA的提取和保存 用磁珠法提取所有对象外周血白细胞DNA，1%琼脂糖凝胶（agarose）电泳定性。紫外分光光度计定量和纯度检测。

1.2.3 SNPscan法检测mt DNA12Sr RNA、GJB2和SLC26A4突变 将纯度及浓度检测合格的基因组DNA样本送上海天昊生物科技有限公司，应用SNPscan技术进行GJB2、SLC26A4和mt DNA12Sr RNA突变筛查。根据美国国家生物技术信息中心和人类基因突变数据库报道的GJB2和SLC26A4基因突变位点，并结合亚洲人群该基因突变特点，检测GJB2基因2个外显子36个突变位点（IVS1＋1G＞A、1A＞G、9G＞A、23C＞T、35delG、34_35insG、95G＞T、95G＞A、109G＞A、134G＞A、139G＞T、157T＞A、164C＞A、167del T、176_ 191del16、187G＞T、230G＞A、232G＞A、235delC、257C＞G、283G＞A、287C＞G、299_300del AT、313_ 326del14、358_360delGAG、382A＞G、408C＞A、416G＞A、427C＞T、439G＞A、493C＞T、511_ 512ins AACG、571T＞C、583A＞G、598G＞A、605ins46）、SLC26A4基因21个外显子77个突变位点（281C＞T、589G＞A、919－2A＞G、1174A＞T、1226G＞A、1229C＞T、1975G＞C、2027T＞A、2168A＞G、1707＋5G＞A、1829C＞A、1927G＞T、1949T＞A、1985G＞A、1991C＞T、2014G＞A、2054G＞T、2086C＞T、2162C＞T、2167C＞G、109G＞T、147C＞G、170C＞A、227C＞T、230A＞T、235C＞T、249G＞A、269C＞T、279T＞A、387delC、398C＞T、404A＞G、414del T、421T＞C、439A＞G、563T＞C、665G＞T、668T＞C、754T＞C、766－2A＞G、907G＞C、916_917insG、946G＞T、1001＋1G＞A、1022delC、1079C＞T、1105A＞G、1160C＞T、1173C＞A、1225C＞T、1238A＞G、1240－1243GAGA＞AAAG、1262A＞C、1264G＞A、1318A＞T、1327G＞C、1334T＞G、1336C＞T、1340del A、1343C＞A、1343C＞T、1371C＞A、1489G＞A、1517T＞G、1520del T、1522A＞G、1540C＞T、1547_1548InsC、1586T＞G、1594A＞C、1595G＞T、1614＋9C＞T、1615A＞G、1673A＞T、1686_1687ins A、1699A＞T、1707＋1G＞A）和mt DNA A1555G及mt DNAC1494T。

操作步骤：①取1μl DNA样本1%agarose电泳进行质量检查及浓度估计；②连接反应预混合液配制，体系1：（1）1.25μl 4×DNA lysis Buffer（1 ×），125μl 4×DNA lysis Buffer（100×）；（2）5μl DNA样本；（3）1μl Probe MixⅠorⅡ（1×），100μl Probe MixⅠorⅡ（100×）；（4）5.75μl DNA稀释液（1×），575μl DNA稀释液（100×）。体系2：（1）2μl 10×Ligase Buffer（1×），200μl 10×Ligase Buffer（100×）；（2）0.5μl Ligase（1×），50μl Ligase（100×）；（3）7.5μl dd H2O（1×），750μl Ligase（100×）；③连接反应：将体系2加入体系1中，盖好PCR仪，按以下程序运行：98℃2 min，5 Cycles×（95℃30 s，60℃for 3 h），94℃2 min，72℃forever，反应结束后加入20μl 20 m MEDTA终止反应；④多重荧光PCR反应，反应体系：（1）10μl 2 ×PCR Master Mix（1×），1 000μl 2×PCR Master Mix（100×）；（2）1μl Primer Mix（1×），100μl Primer Mix（100×）；（3）1μl Ligation Product；（4）8μl dd H2O（1×），800μl dd H2O（100×）。运行程序：95℃for 2 min，9×（94℃20 s，65℃～0.5℃／cycle 40 s，72℃1.5 min），25×（94℃20 s，60℃40 s，72℃1.5 min），68℃1 h，4℃forever；⑤PCR产物稀释20倍后，取1μl与0.1μl Liz 500 SIZE STANDARD，8.9μl Hi－Di混匀，95℃变性5分钟后上ABI3130XL测序仪。⑥收集的原始数据用GeneMapper 4.0软件分析。

1.3 统计学方法 采用SPSS17.0软件对数据进行统计学分析，各民族之间GJB2和SLC26A4基因各种突变等位基因频率的两两比较及各民族之间GJB2、SLC26A4和mtDNA A1555G突变检出率的两两比较均使用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GJB2基因突变检测结果 回族NSHL患者中14例（11.38%，14／123）携带GJB2已知致病突变，其中纯合突变8例，复合杂合突变2例，单杂合突变4例；共发现5种已知致病突变，分别为c.235delC、c.35delG、c.299_300del AT、c.176_ 191del16和c.257C＞G，其中c.299_300del AT等位基因频率最高，为4.47%（11／246），占所有已知致病突变的45.83%（11／24），其次为c.235delC，等位基因频率为3.66%（9／246），占所有已知致病突变的37.5%（9／24）。藏族NSHL患者中2例（占4.55%，2／44）携带GJB2已知致病突变，257C＞G／299_300del AT复合杂合突变1例，c.235delC杂合突变1例。土族NSHL患者中2例（5.88%，2／34）携带GJB2已知致病突变，176_191del16／235delC复合杂合突变1例，c.235delC杂合突变1例。蒙古族NSHL患者中1例（10%，1／10）检测到c.235delC杂合突变（表1）。四个民族之间GJB2基因突变检出率差异无统计学意义（均为P＞0.05）；5种已知致病突变等位基因频率在四个民族之间的差异无统计学意义（均为P＞0.05）。

回族正常对照中检测到1例携带c.235delC杂合突变，等位基因频率为0.5%（1／200），与回族NSHL患者（3.66%，9／246）比较差异有统计学意义（χ2＝5.021，P＜0.05）。而藏族、土族和蒙古族正常对照中均未检测到GJB2基因突变。

表1 GJB2致病突变基因型在回、藏、土及蒙古族NSHL患者中的分布（例）

2.2 SLC26A4基因突变检测结果 回族NSHL患者中8例（6.5%，8／123）携带SLC26A4致病突变，其中2例双等位基因突变；6例单等位基因突变。共发现5种致病突变，分别为c.919－2A＞G、c.2168A＞G、c.2027T＞A、c.1226G＞A和c.754T＞C，其中c.919－2A＞G等位基因频率最高，为2.44%（6／246），占所有致病突变的60%（6／10）。藏族NSHL患者中2例（4.55%）携带SLC26A4致病突变，919－2A＞G／2168A＞G复合杂合突变1例，c.1226G＞A纯合突变1例，其中c.1226G＞A等位基因频率最高，为2.27%（2／88），占所有致病突变的50%（2／4）。土族NSHL患者中1例（2.94%）检测到754T＞C／919－2A＞G复合杂合突变。蒙古族耳聋患者中未检测到SLC26A4致病突变（表2）。回族、藏族、土族之间SLC26A4突变检出率差异无统计学意义（均为P＞0.05），5种致病突变的等位基因频率在四个民族耳聋患者之间的差异无统计学意义（均为P＞0.05）。

表2 SLC26A4致病突变基因型在回、藏、土及蒙古族NSHL患者中的分布（例）

回族正常对照组中检测到1例携带c.919－2A＞G单等位基因突变，等位基因频率为0.5%（1／200），与回族NSHL患者（2.44%，6／246）比较差异无统计学意义（χ2＝2.685，P＞0.05）；而藏族、土族和蒙古族正常对照组中均未检测到SLC26A4基因突变。

2.3 mtDNA12Sr RNA突变检测结果 土族NSHL患者中检测到5例mt DNAA1555G均质性突变，检出率为14.71%（5／34）；蒙古族患者中检测到1例mtDNAA1555G均质性突变，检出率为10.0%（1／10），土族与蒙古族检出率差异无统计学意义（χ2＝1，P＞0.05）；而回族和藏族NSHL患者中均未检测到mt DNAA1555G突变。所有回族、藏族、土族和蒙古族患者均未检测到mt DNAC1494T突变，6例mt DNA12Sr RNAA1555G均质性突变患者均有氨基糖苷类药物应用史。回族、藏族、土族和蒙古族正常对照组中均未检测到mt DNAA1555G和mt DNAC1494T突变。

2.4 GJB2、SLC26A4和mt DNA12Sr RNA突变致聋情况 211例非综合征型耳聋患者中，6例为mtDNAA1555G突变所致（土族5例，蒙古族例）；12例为GJB2基因突变所致，包括纯合突变8例（回族）和复合杂合突变4例（回族2例，藏族1例，土族1例）；5例为SLC26A4双等位基因突变所致（回族2例，藏族2例，土族1例）；因此，本组非综合征型聋患者中10.90（23／211）是由GJB2、SLC26A4和mt DNA12Sr RNA基因突变导致。

3 讨论

GJB2基因突变是导致遗传性NSHL最常见的致病原因之一。目前，已发现GJB2基因有100多种突变方式、多态和未确定变异（http：／／davinci.crg.es／deafness／）。人群调查显示GJB2基因突变在不同种族及地区携带率差别很大，在高加索人种中，约50%的遗传性NSHL患者是GJB2基因突变所致，c.35delG突变占GJB2基因突变的60%～85%；c.167del T是犹太人主要突变形式，占GJB2基因突变的53%［5］；c.235delC是日本人、韩国人和中国人的主要突变形式［6］。Dai等［7］报道中国23个不同地区的汉族NSHL患者中GJB2基因突变检出率为19.1%（313／1640）。在本研究中回族、藏族、土族和蒙古族耳聋患者中GJB2基因突变检出率分别为11.38%（14／123），4.55%（2／44），5.88%（2／34）和10%（1／10），差异无统计学意义；与Dai等［7］报道比较，回族和藏族患者与汉族患者突变检出率差异有统计学意义（均为P＜0.05），而土族和蒙古族患者与汉族患者突变检出率差异无统计学意义（均为P＞0.05）。本研究显示土族和蒙古族NSHL患者GJB2基因的热点突变为c.235delC，与西北地区主要突变［1］相一致，在藏族患者中共检测到3个致病等位基因，各突变等位基因频率相等，不能得出热点突变的明确结论；而c.299_300del AT为回族NSHL患者的热点突变，与马建鹂等［8］报道的c.235delC是西北地区回族NSHL患者最主要突变形式不相符。回族散布于全国，大部分与汉族杂居，从回族形成历史过程来看，其与境内外各相关民族之间存在着相当大的融合，回族中混杂有超过25%的高加索人种血缘［9］；c.35delG是高加索人的主要突变，而c.235delC（优势突变）和c.299_ 300del AT是蒙古利亚人的主要突变，所以种族起源并不能完全解释青海回族NSHL患者携带较高c.299_300del AT突变的现象；这种现象可能是种族、地理环境差异以及民族迁徙融合等多种因素相互作用的结果，但仍需进一步研究证实。

SLC26A4基因是NSHL的主要致病基因，其基因突变谱在不同种族之间有所不同，p.T416P和IVS8＋1G＞A是北欧最常见的两个突变类型［10，11］；p.H723R是日本和韩国患者最主要的突变［3］；IVS7－2A＞G是中国汉族耳聋人群中最常见的突变［12］。Yuan等［13］报道中国汉族NSHL患者的SLC26A4基因突变检出率为16.55%（315／1 903）。在本研究中回、藏和土族患者SLC26A4基因突变检出率分别为6.5%（8／123）、4.55%（2／44）和2.94%（1／34），差异无统计学意义，但均低于Yuan等报道汉族NSHL患者SLC26A4基因突变检出率（均为P＜0.05）。回族NSHL患者SLC26A4基因的主要突变为c.919－2A＞G，与汉族主要突变形式相符；而c.1226G＞A为在藏族NSHL患者主要突变形式，与汉族最常见突变不一致；李琦等［14］报道119例藏族NSHL患者中未检测到c.919－2A＞G突变。Yuan等［15］研究结果表明藏族耳聋基因突变谱与汉族明显不同，提示在对少数民族NSHL患者进行常见耳聋基因筛查时，应注意各民族耳聋基因携带特点。

mtDNA12Sr RNA基因A1555G突变可以导致非综合征型耳聋，且与氨基糖苷类抗生素使用密切相关。Liu等［16］对中国西北地区1 856例汉族聋哑学生进行mt DNAA1555G突变筛查，113例患者携带mtDNAA1555G突变，检出率为6.09%；本研究中土族和蒙古族患者的mt DNAA1555G突变检出率为14.7%和10%，与Liu等报道的检出率比较差异无统计学意义（均为P＞0.05）。氨基糖苷类抗生素因其疗效确切且价格便宜所以在西北地区广泛使用，尤其是农村。携带mt DNAA1555G突变者对氨基糖苷类抗生素特别敏感，即使小剂量的使用也可能导致耳聋；文中6例mt DNAA1555G均质性突变患者均有明确的氨基糖苷类药物使用史，因此，在耳聋人群中筛查mt DNAA1555G突变，发现氨基糖苷类抗生素易感个体，指导其未发病的母系家庭成员避免使用氨基糖苷类抗生素，可以有效减缓或预防药物性耳聋的发生。

综上所述，应用SNPscan技术对青海省回族、藏族、土族和蒙古族的NSHL患者进行常见致聋基因筛查，从分子水平上为10.90%耳聋患者提供了明确的病因学诊断，本组对象中土族和蒙古族的GJB2和SLC26A4基因热点突变与汉族相同，但回族和藏族的基因热点突变与汉族不同；c.299_ 300del AT为回族耳聋患者GJB2基因最常见的突变形式，c.1226G＞A为藏族耳聋患者SLC26A4基因的主要突变形式，表明GJB2和SLC26A4基因突变在青海省主要少数民族NSHL患者中的致病具有民族特异性。

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（2015－12－23收稿）

（本文编辑 雷培香）

The Mutation Analysis of Common Deafness Genes Using SNPscan Technology in Nonsyndromic Hearing Loss Patients of Minority Ethnicities in Qinghai Province

Duan Shihong，Li Yong，Ma Jianli，Yang Xiaolong，Guo Yufen
（Department of Otolaryngology－Head and Neck Surgery，Second Hospital of Lanzhou University，Lanzhou，730030，China）

Objective This study aims to investigate the mutation spectrum and frequency of GJB2，mtDNA12Sr RNA，and SLC26A4 genes in Hui people，Tibetan，Tu nationality，and Mongolian patients with nonsyndromic hearing loss in Qinghai province.Methods Peripheral blood samples were obtained from a total of 211 minority patients with nonsyndromic hearing loss in Qinghai province to extract genomic DNA.Three genes of GJB2，mitochondrialDNA12Sr RNA，and SLC26A4 were screened for mutations in our study cohort using SNPscan technology.Results Among these 211 patients，5 Tu patients and 1 Mongolian patient were found to carry the homoplasmic mtDNAA1555G mutation.The GJB2 mutations detection rates were 11.38%，4.55%，5.88%，and 10% in Hui people，Tibetan，Tu nationality，and Mongolian patients，respectively.No statistically significant differences in the GJB2 mutations detection rates were found among all four ethnicities（P＞0.05）.c.235delC was the mostprevalent mutation in both Tu patients and Mongolian patients.The allele frequency was 2.94%and 5%，respectively.While for Hui patients，c.299_300del AT was the most prevalent mutation with the allele frequency of 4.47%.The mutations detection rates of SLC26A4 were 6.5%，4.55%and 2.94%in Hui people，Tibetan，and Tu nationality patients，respectively.No statistically significant differences in the SLC26A4 mutations detection rates were found among all three ethnicities（P＞0.05）.c.235delC was the most prevalent mutation in Hui patients，the allele frequency was 2.44%.While for Tibetan patients，c.1226G＞A was the most prevalent mutation with allele frequency of 2.27%.Conclusion A total of 10.9%of deaf patients have inherited hearing impairment caused by GJB2，SLC26A4，and mtDNAA1555G mutations.The mutation spectrum of GJB2 and SLC26A4 genes has the ethnic specificity in nonsyndromic hearing loss patients of minority ethnicities in Qinghai province.

Nonsyndromic hearing loss； Mutation； Common deafness genes； Minority ethnicities

10.3969／j.issn.1006－7299.2016.04.003

时间：2016－6－29 16：14

R764.44

A

1006－7299（2016）04－0330－05

1 兰州大学第二医院耳鼻咽喉科（兰州 730030）

段世宏，男，陕西人，副主任医师，医学博士，主要研究方向为耳聋防治研究。

郭玉芬（Email：gyflhmm＠163.com）

网络出版地址：http：／／www.cnki.net／kcms／detail／42.1391.R.20160629.1614.046.html