马羽萍 张殿增 郭雅玲 王裕云 吴 超 西安市第八人民医院(西安710061 )



芪归四逆散抗大鼠肝纤维化的作用机制研究*

马羽萍 张殿增△郭雅玲 王裕云 吴 超 西安市第八人民医院(西安710061 )

目的：用肝纤维化大鼠观察芪归四逆散对实验性肝纤维化的影响。方法：用四氯化碳(CCl4)复制肝纤维化大鼠模型，设秋水仙碱为阳性对照，观察芪归四逆散对肝纤维大鼠血清谷丙转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST) 和白蛋白(ALB)水平以及透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、IV型胶原(C-IV)含量及肝脏组织病理学和超微结构的影响。结果：与模型对照组比较，芪归四逆散组大鼠血清的AST、ALT 以及HA、LN、PCⅢ、C-IV水平明显降低，但ALB明显升高。肝脏的组织病理损害明显改善，胶原沉积减少，纤维增生显著减轻。超微结构研究显示，芪归四逆散组动物的肝窦纤维蛋白沉积明显减少。结论：芪归四逆散可以恢复肝功能，抑制星状细胞的活性，减少肝内纤维蛋白的合成与沉积，促进胶原降解，改善纤维化肝脏的病理学超微结构，具有确切的抗大鼠肝纤维化作用。

四逆散为汉·张仲景《伤寒论》中的和解剂，具有调和肝脾、透邪解郁、疏肝理脾之功效。主治阳郁厥逆证。近年来，在临床上用加味四逆散治疗慢性乙型肝炎性肝纤维化，并获得了明显的疗效[1]。既往实验研究也对加味四逆散拮抗、预防和逆转肝纤维化的作用进行了肯定[2-3]。我们在临床上用芪归四逆散治疗肝纤维化，并获得了显著的临床疗效。本研究主要观察了芪归四逆散对CCL4大鼠肝纤维化的影响。

1 实验材料 1.1 动物及饲料 清洁级(SPF)SD大鼠45 只，雄性，体重200± 20g。动物使用许可证号：SCXK(陕)2012-003，由西安交通大学实验动物中心提供。

1.2 药物及试剂 芪归四逆散剂由柴胡、枳壳、白芍、黄芪、当归、红花、桃仁、川芎、甘草等药组成。实验用其浓缩液(含生药2g/ml)。秋水仙碱，广东彼迪药业有限公司产品，批号：20150001。四氯化碳(CCl4)，天津市天力化学试剂有限公司产品，批号：20111006。橄榄油，山东鲁花集团有限公司产品，批号：20150803LB。大鼠透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、IV型胶原(Collagen IV)Elisa试剂盒均为上海广锐生物科技有限公司产品，批号2015012。大鼠肝脏TGF-β1的一抗和二抗为Pioneer Biotechnology，Inc产品。血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)和白蛋白(ALB)试剂为全自动生化分析仪专用试剂。

1.3 主要仪器 超薄切片机、H7650型透射电子显微镜(日本日立公司)，图像采集与分析系统(德国莱卡公司)，AU5431型全自动生化分析仪(美国贝克曼公司)，POLARstar OPTIMA微板仪(德国BMG Labtechnologies Pty. Ltd)。

2 实验方法 2.1 动物分组与造模 在适应性喂养1周后，对所有动物进行编号并随机分为4组：正常对照组10只，模型对照组15 只，秋水仙碱组 10只，中药治疗组 10只。除正常组外，其余各组动物在第一天皮下注射CCl4原液3 ml/kg，随后每隔三天皮下注射40% CCl4橄榄油溶液3ml/kg，1次，连续6周。在末次注射后次日，从模型对照随机杀死一只大鼠行肝脏病理学检查，按照2000年中华医学会传染病与寄生虫病学分会肝病学分会联合修订的肝纤维化分级标准对实验结果进行评定[4]，直到形成II级以上肝纤维化，即确定肝纤化模型复制成功。

2.2 给药方法 实验开始时，正常对照组和模型对照组大鼠灌胃给予生理盐水，每次2 ml，1次/d；给药组灌胃给予芪归四逆散溶液7.8ml/kg(15.6g/kg)，1次/d，阳性组灌胃给予秋水仙碱溶液0.01 mg/kg，1次/d，连续6周。

2.3 标本采集 于造模和给药结束后，动物用25%乌来糖(20ml/kg)麻醉，经腹主动脉采血，分离血清，用全自动生化分析仪测定血清ALT、AST水平和ALB含量，用Elisa法测定血清HA、LN、PC-Ⅲ、C-IV水平。同时剪取近肝门处的新鲜肝组织两份。一份切成1mm3的小块，用2.5%戊二醛(pH 7.3-7.4)固定，供电子显微镜检测用，另一份用10%甲醛固定，用于病理学和免疫组化检测。

3 结 果 3.1 对血清转氨酶与白蛋白水平的影响 于实验末，动物用25%乌来糖(20ml/kg)麻醉，经腹主动脉采血，分离血清，用全自动生化分析仪测定血清ALT、AST水平和ALB含量，结果如表1所示。

表1 芪归四逆散对肝纤维化大鼠血清转氨酶、白蛋白的影响

表1中的结果显示，与正常对照组比较，模型对照组动物的ALT和AST水平均明显提高(P<0.01)，ALB则明显降低(P<0.01)。与模型对照组比较，芪归四逆散给药组和秋水仙碱阳性对照组的ALT、AST水平均明显降低(P<0.01)，而ALB明显提高(P<0.05)。

3.2 血清纤维化指标的影响 用Elisa法测定血清HA、LN、PC-Ⅲ、C-IV水平，结果如表2所示。

表2 芪归四逆散对肝纤维化大鼠血清HA、LN、C-IV和PCⅢ水平的影响

表2中的结果显示，与正常对照组比较，模型对照组动物的血清HA、LN、C-IV和PcⅢ水平均明显提高(P<0.01)。与模型对照组比较，芪归四逆散给药组和秋水仙碱阳性对照组的血清HA、LN、C-IV和PcⅢ水平均明显降低(P<0.01)。

3.3 肝脏病理学的影响 于实验末，剪取肝脏组织，10%多聚甲醛固定，经脱水、石蜡包埋、切片后，分别用HE和Masson染色，在光镜下观察肝脏的组织病理学。

在光镜下发现，正常对照组动物HE染色时的肝组织结构清晰，肝小叶结构完整，肝索排列整齐；Masson染色仅见中央静脉和汇管区有少量蓝染。HE染色发现，模型组肝板结构紊乱，有假小叶形成，肝细胞水肿，汇管区和小叶内可见炎细胞浸润，并见桥接样坏死；Masson染色见纤维间隔形成，汇管区明显扩大，界板破坏，中央静脉及窦周大量胶原沉积。芪归四逆散给药组和秋水仙碱阳性对照组的肝组织病变程度明显比模型对照组轻，Masson染色见结缔组织增生程度明显减轻，有些形成的网状结构断裂或消失。这些结果说明芪归四逆散有抗肝纤维化的作用。

3.4 转化生长因子(TGF)β1表达水平的影响 免疫组化的阳性结果是细胞的浆膜出现棕黄色颗粒。检测时每个图片取5个视野，计算出阳性染色面积占总面积的百分比，结果如表3所示。

在光镜下可见，正常对照组的TGFβ1的表达很少，且呈散在性分布，主要见于汇管区、门静脉以及中央静脉周围的结缔组织。与正常对照组比较，模型对照组的TGFβ1分布明显增多，而且广泛(P<0.01)，除了汇管区、门静脉和中央静脉外，在纤维间隔以及一些不规则细胞也有分布。而给药组和秋水仙碱组TGFβ1的表达明显低于模型对照组(P<0.01)，结果与病理学检查结果一致。说明芪归四逆散可以减少肝纤维化大鼠肝组织TGFβ1的表达。

表3 芪归四逆散对肝纤维化大鼠TGFβ1表达的影响

3.5 对超微结构的影响 在透射电镜下观察发现，正常组大鼠的肝细胞呈多边形，核圆，位于细胞中间，血窦面微绒毛密集而丰富；肝窦内皮细胞(SEC)呈扁平状，远侧胞质不连续，细胞间有许多窗孔；库佛细胞(KC)和肝星状细胞(HSC)形状不规则，Diss间隙正常，肝脏内毛细血管通畅。模型对照组动物的肝细胞有坏死表现，吞噬细胞和中性粒细胞聚集，多数肝细胞内出现空泡和脂肪滴；血窦面微绒毛稀疏、紊乱；毛细血管内有微血栓形成；SEC增多，细胞间窗孔减少或消失，显示肝窦出现毛细管化改变；KC染色浅。Diss间隙狭窄，且部分内有胶原纤维沉积；HSC较多。秋水仙碱组动物的肝细胞坏死不明显，细胞内有少量空泡和脂肪滴，部分细胞结构出现紊乱，少数SEC肿胀，胞浆内有大量的胞饮小泡，胞间有间断性窗孔。Diss腔和窦周间隙仍然可见有少量胶原纤维。芪归四逆散组的超微结构改变较病理模型组明显减轻，结果与秋水仙碱组类似。这些结果与病理学结果一致说明，芪归四逆散有明显的抗肝纤维化作用。

A. 正常的对照组 B. 模型对照组 C. 芪归四逆散组 D. 秋水仙碱阳性对照组

4 讨 论 肝纤维化是一种主动进展的、可逆的基质代谢失衡和肝脏结缔组织重构的过程，是肝星状细胞在各种损肝因素持续刺激下被激活，大量合成细胞外基质在肝内沉积引起肝小叶结构改变的病理过程[5]。当肝纤维形成之后，肝脏功能即会异常，转氨酶水平会升高，白蛋白会下降，当肝星状细胞被激活时，肝细胞外基质的成分、降解产物及其参与代谢的酶的水平也会明显升高。

大量研究证明，在肝纤维化形成过程中，肝星状细胞(HSC)被活化，演变为成纤维细胞而迅速增殖和分泌大量的胶原纤维蛋白[6]。此外，HSC活化后还分泌TGFβ、血小板衍生因子等以维持自身的活化状态。所以，肝组织中的TGFβ含量是星状细胞活化的标志。

本实验结果显示，与正常对照组动物比较，模型对照组动物的血清ALT、AST、ALB与HA、LN、C-IV和PcⅢ水平均明显升高，肝纤维化的病理学改变明显，说明肝纤维化模型建造成功。加味四逆散处理组动物的血清ALT、AST与HA、LN、C-IV和PcⅢ水平明显降低，ALB明显升高，肝脏的组织病理学改变得到明显地改善,说明芪归四逆散具有明显的抗肝纤维化作用。另外，模型对照组动物血清的TGFβ水平明显高于正常对照组，芪归四逆散组动物的TGFβ水平明显降低,说明芪归四逆散可能是通过抑制星状细胞活化产生抗肝纤维化作用的。

中医认为将肝纤维化归属于 “积聚”或“积证”的范畴更为准确[7]。在肝纤维化发生后，中医学上认为的肝藏血、主疏泄的功能失常，出现积聚、积证等症候。在治疗上多采用活血化瘀、散结解聚的方药[8]。本实验所用的芪归四逆散中就是在四逆散和解药的基础上添加了黄芪、当归、红花、桃仁、川芎等活血化瘀的药物，减少了肝纤维化大鼠肝细胞损伤、SEC水肿以及内皮侧基底膜形成，改善了肝窦毛细血管化，减少了RER膜上的多聚核蛋白体解聚及脱粒和SER膜增生，减少了微循环内的血栓，从超微结构上证明了芪归四逆散的抗肝纤维化的作用。

[1] 孙守才，刘光炜. 加味四逆散治疗慢性乙型肝炎肝纤维化的初步研究[J].陕西中医学院学报，2001,24(1)：46-47.

[2] 郑旭锐，叶建红，周新颖,等. 加味四逆散对肝纤维化大鼠肝组织转化生长因子β1、结缔组织生长因子mRNA影响的研究[J].时珍国医国药，2009,20(10)：2597-2598.

[3] 郑旭锐，孙守才，李长秦. 加味四逆散治疗肝纤维化量效关系实验研究[J]. 吉林中医药，2008,28(5)：377-378.

[4] 中华医学会传染病与寄生虫病学分会肝病学分会．病毒性肝炎防治方案[S]．中华肝脏病杂志，2000，8(6)：324-329．

[5] 王 台.恩替卡韦联合复方鳖甲软肝片治疗慢性乙型肝炎肝纤维化36例[J].陕西中医，2011,32(9):1115-1116.

[6]WilasrusmeeC,SiritheptaweeS,KanchanapanjaponS,etal.Ultrastructuralchangesincirrhoticandnoncirrhoticpatientsduetohepatectomy[J].JHepatobiliaryPancreatSurg,2004,11(4) :266-271.

[7] 马羽萍. 薛泱洪抗肝纤维化治疗经验[J].陕西中医,2014,35(2):214-215.

[8] 雷 娜，郑仕中，陆 茵. 活血化瘀类中药防治肝纤维化的机制及研究进展[J]. 中华中医药杂志，2010,25(2): 265-268.

(收稿2016-06-28；修回2016-08-03)

The Effects and mechanism of astragalus& angelica Qigui Sinisan against hepatic fibrosis of rats

Xi’an Eighth People's Hospital(Xi’an710061) Ma Yuping Zhang Dianzeng Guo Yaling et al

Objectives: To observe the effects of Qigui Sinisan against experimental hepatic fibrosis via in rats. Methods: To establish the rat hepatic fibrosis model with CCl4,colchicine as the positive control,and observe the effect of Qigui Sinisan on rats with hepatic fibrosis,in terms of the levels of serum ALT,AST and ALB,the contents of HA,LN,PCⅢ and C-IV,as well as liver-tissue pathology & ultrastructure. Results: Compared with the model group,in the Qigui Sinisan group,the levels of serum AST,ALT,but ALB,as well as HA,LN,PCⅢ,C-IV lowered significantly, the pathological damage on liver tissue significantly repaired,the collagen deposition significantly reduced,and the fibroplasia significantly relieved. According to ultrastructure studies,hepatic-sinusoid fibrin deposition of animals decreases significantly in Qigui Sinisan group. Conclusion: Qigui Sinisan can restore liver function,inhibit the activity of stellate cell,reduce synthesis and deposition of liver fibrin,promote collagen degradation,and improve pathological ultrastructure of hepatic fibrosis,having the definite effect against hepatic fibrosis in rats.

Liver fibrosis/traditional Chinese medicine therapy @Qigui Sinisan Carbon tetrachloride Rats Animal experimentation

*西安市卫生局重点学科优势专科建设项目(2015228)

肝纤维化/中医药疗法 @芪归四逆散 四氯化碳 大鼠 动物实验

R575.2

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2016.11.053

△西安交通大学医学部 (西安710061)