李先建 何剑波 陈闯 黄山 连芳 赵荫农 邬国斌

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC，简称肝癌）是最常见的恶性肿瘤之一，发病率位居恶性肿瘤第五位［1，2］。目前尽管有许多治疗肝癌的方法，但肝癌患者的预后仍较差［3］。因此，探索新的治疗方法尤为必要。水蛭素是从水蛭中分离出的多肽类蛋白，具有抗血栓作用，临床上常用于治疗心脑血管疾病［4-5］。近年研究显示水蛭素具有抗肿瘤作用，可抑制多种癌细胞增殖及转移［6-8］。然而水蛭素对肝癌HepG2细胞生物学行为的影响及其对肝癌HepG2细胞血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowth factor，VEGF）表达量的影响报道较少，本研究主要观察水蛭素对肝癌HepG2细胞生物学影响，并探讨其初步机制，以期为水蛭素治疗肝癌提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

肝癌HepG2细胞株购于中科院上海细胞研究所。血清和RPMI-1640培养基购自HyClone公司。水蛭素由南宁市净血皇生物工程有限公司赞助。凋亡试剂盒、基质胶购自BD公司。逆转录试剂盒及荧光定量PCR试剂盒购自Toyobo公司。Western blot设备购自Bio Rad公司。VEGF抗体购自Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 肝癌HepG2细胞培养于含10%胎牛血清RPMI-1640培养液中，在37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养、传代。

1.2.2 MTT法检测细胞增殖活性 取对数生长期的肝癌HepG2细胞，0.05%胰蛋白酶消化、1000 r/min离心5 min，PBS洗涤3次，加于含10%胎牛血清RPMI-1640培养液制成单细胞悬液，接种于96孔板，每孔约5 000个细胞，培养24 h。以不同浓度水蛭素（1 U/mL、2 U/mL、4 U/mL、8 U/mL）培养液作用于肝癌 HepG2 细胞，另设空白对照组。各组分别培养24 h、48 h、72 h后，加入MTT溶液20 μL，培养4 h，弃培养液，再加入150μLDMSO，室温振荡混匀10 min，选490 nm波长，在酶标仪上测定OD值。每次实验设3个复孔，重复3次。……