谢秋玲　陶　悦　张小秦　莫　茜　金燕樑

(上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心风湿免疫科，上海200127)



人Cosmc胞外段蛋白在昆虫细胞Sf-9中的表达与纯化研究①

谢秋玲陶悦张小秦莫茜金燕樑

(上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心风湿免疫科，上海200127)

目的：利用昆虫细胞Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达人Cosmc 胞外段蛋白，为体外研究Cosmc蛋白的结构和功能奠定基础，同时也为O-连接糖基化及相关疾病的研究提供思路。方法：采用Bac-to-Bac系统，构建重组转移质粒pFastBac1-Cosmc extracellular domain(pFastBac1- Cosmc ED)，转化到含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中，通过蓝白斑筛选和PCR鉴定，获得重组转座子rBacmid-Cosmc ED。在脂质体介导下，重组病毒感染Sf-9无血清细胞，在Sf-9中表达Cosmc 胞外段蛋白，由于Cosmc N端加有昆虫细胞信号肽HBM(Honey Bee Melittin)且不含有跨膜段，所以Cosmc胞外段蛋白表达后分泌到培养基上清中，通过SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行检测，并通过Ni-NTA亲和层析柱对其进行纯化分析。结果：SDS-PAGE和Western blot分析显示得到一条分子量约为33 kD的特异性条带，与目的蛋白大小相符，质谱结果进一步证明所得蛋白为Cosmc胞外段蛋白。结论：Sf-9细胞中可成功表达Cosmc胞外段蛋白，为进一步研究Cosmc的结构和功能奠定基础。

人Cosmc 胞外段；昆虫细胞；杆状病毒表达系统；表达纯化

蛋白质的糖基化方式主要有两种：N-连接和O-连接[1]。其中，黏蛋白型O-聚糖的合成是在高尔基体中由一系列糖基转移酶催化而成[2]。C1GALT1作为O-糖基化的关键酶，可催化半乳糖Gal从UDP-Gal转移到Tn抗原(GalNAc α1-O-Ser/Thr-)上从而形成T抗原(Core 1 Galβ1,3 Gal NAc -α-O-Ser/Thr)。在哺乳动物细胞中，有活性的C1GALT1的形成需要其分子伴侣Cosmc(即C1GALT1C1)的共表达[3]。……