郝志敏 向志 栾超 杨永红 胡煜 陈浩 陈敏 王宝玺

·论著·

CD69+T细胞在银屑病皮损中的表达及其临床意义

郝志敏 向志 栾超 杨永红 胡煜 陈浩 陈敏 王宝玺

目的 探讨银屑病患者皮肤CD69+T细胞的表达及其与疾病活动性的关系。方法 免疫组化检测31例银屑病患者皮损和非皮损中CD69+T细胞在皮肤中的表达，与6例健康人进行对照。结果CD69+T细胞主要分布于皮肤真皮。31例银屑病患者皮损和非皮损的真皮中，CD69+T细胞分别为（35.16±12.67）%和（8.70±3.29）%，皮损明显高于非皮损（t=12.5，P＜0.01）。6例健康人对照皮肤中CD69+T细胞（8.71±2.55）%，明显低于银屑病皮损（t=5.03，P＜0.01），与非皮损相比，差异无统计学意义（t=0.05，P＞0.05）。20例急性期与11例稳定期银屑病患者皮损中CD69+T细胞分别为（40.89±10.31）%和（24.46±9.49）%，急性期明显高于稳定期（t=0.36，P＜0.01）。结论 银屑病患者皮损中CD69+T细胞表达增高，与疾病的活动性有关。

银屑病；CD69阳性T淋巴细胞；肿瘤坏死因子α；免疫组织化学

CD69是一种诱导激活分子，由活化淋巴细胞表达，在T细胞活化、增殖和分化以及细胞因子如肿瘤坏死因子（TNF）α的分泌中起作用。研究发现，在正常人部分外周淋巴组织的T细胞及B细胞中，可检测到CD69，在一些慢性病中，如类风湿性关节炎、慢性病毒性肝炎，CD69持续表达在CD8+T细胞上，造成组织损伤［1］。关于CD69在银屑病皮损中的表达及其作用研究甚少。我们通过免疫组化技术检测银屑病患者皮损、非皮损中CD69的表达，分析其与银屑病皮损严重程度的关系及临床意义。

作者单位：210042 南京，中国医学科学院 北京协和医学院 皮肤病医院 江苏省皮肤病与性病分子生物学重点实验室 皮肤科（郝志敏、向志、栾超、胡煜、陈敏、王宝玺），中心实验室（杨永红），病理科（陈浩）

1 对象与方法

1.1 对象：31例斑块状银屑病患者来源于中国医学科学院皮肤病医院门诊，经临床或组织病理学诊断为寻常性银屑病，男20例、女11例，年龄19～52（39.4±10.3）岁，病程18 d至20年，银屑病皮损面积和严重程度指数（PASI）评分4～36（16.59±9.58），其中20例急性期（旧皮疹扩大或新皮疹出现、炎症明显、周围红晕，有同形反应），11例稳定期（无新皮疹出现，旧皮疹未消退）。皮肤钻孔采集同一患者皮损和非皮损组织（均取自背部）。6例健康对照皮肤来源于我院外科整形手术多余的正常皮肤（取自背部），其中男5例，女1例，年龄19～46（32.2±8.6）岁。患者和健康对照组在性别和年龄上比较差异无统计学意义。本研究经本院医学伦理委员会批准，患者签署知情同意书。

1.2 试剂：鼠抗人CD69单克隆抗体均产自英国Abcam公司，按1∶25稀释。磷酸盐缓冲液由美国Gibco公司生产。枸橼酸抗原修复缓冲液、内源性过氧化氢酶抑制剂、非免疫动物血清（羊）、辣根过氧化物酶标记抗羊鼠IgG、二氨基联苯胺显色试剂盒、苏木素和中性树胶均产自福州迈新生物技术有限公司。

1.3 方法：

1.3.1 免疫组化：常规钻孔取躯干皮损处直径5mm皮肤标本，经甲醛固定、脱水、石蜡包埋、连续切片厚5 μm薄片，免疫组化染色按照染色试剂盒操作说明进行，所有切片均在同一质控条件下进行，设阳性和阴性对照。染色为二氨基联苯胺染色，阳性为棕黄色。

1.3.2 结果判定：CD69阳性表达定位于细胞膜，结果为棕黄色颗粒。计算真皮中5个显微镜高倍视野（×200）下CD69阳性表达的T细胞平均百分比。

1.4 数据处理：采用SPSS18.0软件进行统计分析，结果进行方差齐性检验，两组间比较采用t检验，相关性分析采用Pearson检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

31例银屑病患者皮损和非皮损、6例健康对照皮肤中均可见表达CD69+T细胞。银屑病患者皮损中CD69+T细胞分布广泛，包括表皮和真皮，主要分布在真皮浅层，其中急性期患者皮损真皮中CD69+T细胞较稳定期多。21例患者（16例急性期，5例稳定期）皮损表皮内可见阳性细胞，数量少（未统计）。非皮损中CD69+T细胞主要分布在真皮内血管周围，5例患者（3例急性期，2例稳定期）表皮内可见阳性细胞，数量极少（未统计）。6例健康对照皮肤中CD69+T细胞少量分布于真皮浅层，1例表皮内可见阳性细胞（图1）。

31例银屑病患者皮损和非皮损真皮中CD69+T细胞分别为（35.16± 12.67）%和（8.70± 3.29）%，皮损明显高于非皮损（t=12.5，P＜0.01）。6例健康对照皮肤真皮中CD69+T细胞（8.71±2.55）%，明显低于银屑病患者皮损（t=5.03，P＜0.01），与非皮损相比，差异无统计学意义（t=0.05，P＞0.05）。20例急性期与11例稳定期银屑病患者皮损真皮中，CD69+T细胞分别为（40.89±10.31）%和（24.46±9.49）%，急性期明显高于稳定期（t=0.36，P＜0.01）。银屑病患者皮损及非皮损真皮中，CD69+T的表达与PASI值不相关（分别为r=0.27，P＞0.05；r=0.20，P ＞0.05）。

3 讨论

CD69是Ⅱ型膜蛋白，有高糖基化的亚基组成的二聚体。Caruso等［2］研究发现，CD69被细菌超抗原快速诱导，T细胞受到刺激后快速表达CD69，若无持续刺激，其在6～8 d后逐渐下降。表明CD69在激活的淋巴细胞表达较早，且与细胞激活同步。有研究表明，通过测定CD69的表达可以了解T细胞对各种刺激原的免疫反应功能［3］。Gordon 等［4］用阿法赛特每周7.5 mg治疗银屑病12周后，发现皮损中活化T细胞（表达CD69和CD3）明显减少，且T细胞的减少与PASI评分的改善相关。在Ferenczi等［5］研究中，银屑病皮损表皮中CD69+T细胞表达百分比明显高于真皮，非皮损以及正常对照中未见CD69+T细胞，但未发现患者外周血中CD69表达增高。朱可建等［6］研究发现，银屑病患者外周血中CD8+T细胞表达CD69的水平明显高于健康人，且进行期明显高于消退期，与疾病严重程度呈正相关。

研究证实，同一免疫因子在皮肤真皮和表皮中可能发挥不同的作用。本研究中，CD69+T细胞在皮肤中的表达主要分布于真皮，与Ferenczi等［5］研究结果不同，分析Ferenczi等应用流式细胞法分别测量表皮与真皮内CD69+T细胞，而本研究应用免疫组化法，故可能造成结果的差异。有意义的是，本研究发现，皮损真皮中CD69+T细胞百分比较非皮损和正常对照组明显增高，但皮损真皮中，CD69+T细胞百分比与PASI值不相关。Gordon等［4］研究的是整个皮肤中CD69+T细胞的表达，而且入组的患者病情严重，PASI值高，本研究分析的是真皮中CD69+T细胞的表达与PASI的关系，且入选的患者PASI评分差异较大（4～36）。另外，本研究还发现，皮损真皮中CD69+T细胞的表达反映病情活动性（即患者是否处于急性期），与Caruso等［2］的观点一致。至于为何会出现病情活动性与PASI评分不一致，分析PASI评分由红斑、脱屑、浸润和面积因素决定，且皮损受累面积对PASI评分影响十分显著，故高PASI评分并不代表该患者处于急性期。

图1 银屑病皮损连续切片染色结果：表皮和真皮均有CD69+T细胞，可见棕黄色颗粒（免疫组化×200）。皮损中（1A，1B）CD69+T细胞分布广泛，包括表皮和真皮浅深层，主要分布于真皮浅层。其中急性期（1A）皮损真皮中CD69+T细胞百分比较稳定期（1B）高。非皮损（1C）中CD69+T细胞主要分布在真皮浅层和血管周围。正常对照（1D）皮损中CD69+T细胞少量分布于真皮浅层

随着对CD69的免疫调控作用认识的深入，有研究发现，CD69的缺失导致免疫反应的增强［7-8］。CD69对免疫反应的限制主要由于：①CD69诱导活化后的T淋巴细胞凋亡；②在抗原提呈过程中，部分活化信号可能同时诱导CD69表达，造成一种无功能免疫状态（这是CD69+T细胞在慢性炎性反应中的特点）。确信的是，这些无活力的淋巴细胞与某些尚未定义明确的调节T细胞相符。它们通过产生转化生长因子（TGF）β或其他免疫因子，对淋巴细胞起到监督作用，调节局部或系统免疫；③CD69可能参与Th1/Th2细胞分化比例的调节［9］，这种免疫调控在类风湿性关节炎［10］的病程慢性化中起到一定作用。

近年来研究发现一种特殊的CD69+T细胞亚群，为CD69和CD103共表达的T细胞，具有特殊功能。在银屑病皮损中虽然数量极少，但在皮损消退后能停留在外周皮肤组织中［11-12］。Torres-Alvarez等［1］应用甲氨蝶呤（12.5 mg/周）治疗银屑病，发现皮损消退后，表达CD69的CD8+T细胞在皮损中持续存在。淋巴细胞外移需要磷酸鞘氨醇受体1（S1P1）、干扰素α/β诱导CD69在细胞表面表达，CD69抑制S1P1化学作用，导致S1P1下调，从而使T淋巴细胞定位于局部组织［13］。以上研究提示，CD69+T细胞可能参与银屑病皮损的复发机制。

本研究的不足之处：由于收集的健康对照皮肤多来自包皮切除术的包皮皮肤，在实验过程中发现由于包皮色素细胞较多，影响了CD69+T细胞数量的统计，因此，没有把这部分样本纳入，导致对照组样本较少。此外，不同于外周血样本，银屑病患者皮肤的样本获得非常困难，尤其是非皮损皮肤。

综上所述，CD69+T细胞与银屑病的活动性和复发均有关，但其在病程不同阶段的表达以及具体功能、活化机制以及调节机制尚待进一步研究。

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［4］Gordon KB,Vaishnaw AK,O ′Gorman J,et al.Treatment of psoriasis with alefacept:correlation of clinical improvement with reductions of memory T-cell counts ［J］.Arch Dermatol,2003,139（12）:1563-1570.DOI:10.1001/archderm.139.12.1563.

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Expression of CD69+T lymphocytes in psoriatic lesions and its clinical significance

Hao Zhimin*,Xiang Zhi,Luan Chao,Yang Yonghong,Hu Yu,Chen Hao,Chen Min,Wang Baoxi.*Department of Dermatology,Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College;Jiangsu Key Laboratory of Molecular Biology for Skin Diseases and STIs,Nanjing 210042,China

ObjectiveTo measure the expression of CD69+T lymphocytes in skin lesions of patients with psoriasis,and to explore its relationship with disease activity.MethodsLesional and non-lesional skin samples were collected from 31 patients with psoriasis,and normal skin samples obtained from 6 healthy individuals served as controls.Immunohistochemical staining was performed to measure the expression of CD69+T lymphocytes in these skin samples.ResultsCD69+T lymphocytes were mainly distributed in the dermis.The percentage of CD69+T lymphocytes was significantly higher in lesional skin than in non-lesional skin（35.16% ±12.67%vs.8.70% ±3.29%,t=12.5,P＜0.01）,higher in lesional skin from 20 patients with acute psoriasis than in that from 11 patients with stable psoriasis（40.89% ±10.31%vs.24.46% ±9.49%,t=0.36,P＜ 0.01）,but significantly lower in normal control skin than in lesional skin （8.71% ± 2.55%vs.35.16% ±12.67%,t=5.03,P＜0.01）,and insignificantly different between normal control skin and nonlesional skin （t=0.05,P＞ 0.05）.ConclusionThe expression of CD69+T lymphocytes is markedly increased in psoriatic lesions,which may be associated with disease activity.

Psoriasis;CD69-positive T-lymphocytes;Tumor necrosis factor-alpha;Immunohistochemistry

s:Chen Min,Email:drchenmin@126.com;Wang Baoxi,Email:wangbx@ncstdlc.org

2015-04-27）

卫生公益性行业科研专项经费项目（201002016）

Fund program:Research Special Fund for Public Welfare Industry of Health （201002016）

10.3760/cma.j.issn.1673-4173.2016.03.002

陈敏，Email:drchenmin@126.com；王宝玺：Email:wangbx@ncstdlc.org