杜洪 金荣

三种不同脱钙液在骨组织石蜡切片中的应用比较

杜洪 金荣

目的：比较不同的脱钙液对骨组织的脱钙能力，优化骨组织石蜡切片的制作流程。方法：选取15例手术切除的新鲜骨标本，运用3种不同的脱钙液（Jenkins脱钙液、14%硝酸水溶液、14%硝酸甲醛生理盐水溶液）进行脱钙，记录脱钙时间，常规脱水、切片、HE染色，镜下观察，对比3种脱钙液对骨和骨髓组织常规病理切片质量和HE染色效果。结果：14%硝酸甲醛生理盐水溶液组脱钙能力最强，脱钙最均匀，耗时最短，既能有效完全除去骨皮质中的钙质，又能保护骨髓组织及细胞的形态完好，切片质量和HE染色的效果最佳；14%硝酸水溶液组脱钙液，使骨组织疏松发泡，组织变黄，对组织的损伤大，脱钙不均匀，组织切片不完整，制片质量和HE的效果最差；Jenkins脱钙液组对组织的脱钙能力、损伤程度、制片质量和HE染色效果良好，14%硝酸甲醛生理盐水溶液组和14%硝酸水溶液组之间。结论：3种脱钙液对骨和骨髓组织都具有良好的脱钙能力，制片质量及HE染色效果比较，14%硝酸甲醛生理盐水溶液＞Jenkins脱钙液＞14%硝酸水溶液；14%硝酸甲醛生理盐水溶液最适用于临床常规病理制片中骨和骨髓组织的脱钙。

骨组织；脱钙液；HE染色

骨组织是由骨细胞和骨基质组成的坚硬的结缔组织，骨基质富含以磷酸钙和碳酸钙为主的无机钙盐，二者的存在造成骨组织的硬度较大，不易切片且极易脱片，即便能够勉强制成切片，在蓝色钙盐背景下也难以看清细胞结构，对病理诊断工作造成很大的不便，因此在临床病理活检或实验性动物研究中必须要进行脱钙处理才能进行常规制片和观察［1］。但是，如果骨组织脱钙过度又会严重影响组织细胞染色效果，或使组织抗原丢失，从而影响对病变组织的病理诊断或科学实验工作［2］。由于骨组织的特殊性也就有了相应的技术和方法，掌握好骨组织的石蜡制片方法，对于提高诊断率，减少误诊，具有一定的实用价值［3］。本研究针对骨组织的特殊性，选择三种不同的脱钙液进行脱钙，比较其脱钙效果和对HE染色的影响。在固定、脱钙、碱化、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片及染色等技术进行探讨和经验总结，得到既方便临床应用，又适合科学研究的骨组织制片方法。

1 材料和方法

1.1 材料 选取我院送检骨组织标本15例，切成1cm×1cm×0.2cm的骨块，每份样本取三块。组织离体后即用新鲜配制的体积分数10%甲醛水溶液充分固定，取材，分别投入14%硝酸甲醛生理盐水溶液、14%硝酸水溶液和Jenkins水溶液3组脱钙液中脱钙，记录脱钙终点的时间，包埋盒标记脱水。

1.2 试剂及仪器 甲醛、浓盐酸、冰醋酸、冰乙酸、硝酸、氯仿、无水乙醇、二甲苯（分析纯），生理盐水；石蜡苏木素染液 伊红染液。高级智能脱水机（Leica AsP300S）、组织包埋机（Thermo）、切片机（Thermo）、摊片烤片机（TKY-TKB）、多功能染色机（Leica ST5020）、自动盖片机（CV5030）。

1.3 脱钙液配制试验分组处理［4-6］见表1。

表1 脱钙液配制及方法分组

1.4 方法 将送检骨组织进行常规取材，浸入预先配制好的10%甲醛水溶液固定液中固定8h，将固定充分的骨组织取出，分别置于装有适量的脱钙液的100m l广口瓶中，进行脱钙处理，并适时观察组织颜色及骨组织脱钙程度，检查脱钙效果，定期更换脱钙液，记录脱钙时间。脱钙“终点”测定：取脱钙2h后的脱钙液5ml，加入浓氨水数滴，调制中性（PH7.2），再加入5%草酸钠，如液体浑浊，说明液体中有钙质，每隔2h重复测定，当反应至5分钟仍无沉淀，表示脱钙已达终点，此时骨组织肉眼呈半透明状，漂浮在脱钙液面，用手按压柔软有弹性，不刺手，无粗糙砂粒感，大头针可以轻松刺入骨皮质。脱钙终止后将脱钙完全的骨组织放入碱化液处理2h，流水冲洗1h，依次浸入70%、80%、90%、95%乙醇I、II脱水各1h，100%乙醇I、II各1h；二甲苯I、II各透明30min，常规浸蜡、包埋、切片、常规HE染色，镜下观察结果。

1.5 观察指标 ①骨组织脱钙时间；②骨组织HE染色效果。

2 结果

经上述方法比较得出：14%硝酸甲醛生理盐水溶液脱钙后，组织常规制片效果较好，无皱缩、龟裂、膨胀现象，切片平坦，薄厚均匀；染色结果：细胞核呈蓝色，骨基质、骨原纤维、红细胞、软骨呈不同程度的红色，脱钙效果结果稳定。见表2。

表2 三种脱钙液处理时间以及常规制片分析比较

3 讨论

脱钙是指用化学或物理方法将骨组织中的钙盐和胶原纤维分离“除去钙盐”获得完整的胶质纤维成分［7］，骨组织含有大量的钙盐和无机盐，需经过脱钙处理，使组织软化后才能进行切片处理。常用的脱钙剂主要包括单纯酸类、混合酸类、螯合剂等［8］。骨组织制片对临床病理检查非常重要，因而应选择较好的脱钙液对所选骨组织标本进行较好的脱钙处理，且不破坏细胞和组织结构，形态清楚，进而确保组织制片的效果较好并合适临床诊断需要［9］。在骨组织石蜡切片观察骨组织学形态的研究中，组织学切片的制作是关键。石蜡切片的制作过程包括许多步骤，如固定、脱钙、包埋、切片、染色等。其中，标本的固定和脱钙是骨组织石蜡切片制作中最为重要的步骤，直接影响着切片的质量。脱钙选用甲醛、硝酸和冰乙酸复合溶液，对骨内的磷酸钙和碳酸钙，分解较快，对骨组织损害较小，且染色效果较好［10］。

脱钙：“终点”测定是用化学方法，草酸钠沉淀的原理，简便易行，安全可靠。脱钙后用碱化液处理，目的在于，在脱钙过程中，酸性溶液打碎了骨组织中蛋白分子的横链，并释放出可以同水分子结合的亲水基因，引起骨组织膨胀，经碱化液处理，变成中性，保证制片和染色的最佳效果。

在整个制作过程中还应注意以下几点：①取材时骨组织块不易过厚，一般在5mm左右，以免脱钙时间过长影响染色效果；②脱钙液要充足，一般为标本体积的20～30倍，并注意多次更换新液；③脱钙湿度在20℃以上，不宜过低，如在10℃以上，会使脱钙速度减慢，引起组织伤害；④在整个脱钙过程中切忌使用金属容器和器械，尽量采用玻璃器皿；⑤在脱蜡后染色前，要充分水洗，以利于染色；⑥在染苏木素时要适当延长时间，一般比常规时间长一倍，染伊红时间不宜过长，这样可以得到较好的对比度，使色彩鲜艳；⑦切片时刀要锋利，不要有缺口，卷刀，否则切片困难；⑧骨组织切片染色易出现脱片现象，最好用玻片附贴剂。

［1］张绪斌，熊正文，张华东，等.骨组织脱钙技术及其应用［J］.医学理论与实践，2011，24（11）:1264-1266.

［2］潘利锋，吴旭，夏建军，等.不同脱钙液对牙齿牙周联合石蜡切片HE染色的影响［J］.中国疗养医学，2009，18（12）:1123-1125.

［3］胥维勇，杨群.脱钙方法与脱钙液的选择及应用［J］.中国组织化学与细胞化学杂志，2002，11（3）:263-263.

［4］罗灿峤，木琼，钟觉民.不同的脱钙液在骨组织制片中的比较应用［J］.中国实用医药，2011，6（19）:27-28.

［5］罗灿峤，莫木琼，聂钊铭，等.四种脱钙液对骨和骨髓组织及结构影响的比较［J］.中国组织工程研究，2015，19（37）:5928-5932.

［6］缪勇建.介绍一种骨髓穿刺活检的理想脱钙剂及其HE染色法［J］.广西医科大学学报，2008，25（2）:311-311.

［7］陈世梁，卢志承，董玉英.介绍一种改良脱钙液在骨组织制片中的应用［J］.临床与实验病理学杂志，2009，25（5）:557-555.

［8］马少卿.骨髓活检标本脱钙方法的改良［J］.诊断病理学杂志，2012，19（2）:110.

［9］万蕾，章锦才，轩东英，等.不同脱钙方式观察牙髓组织切片的效果比较［J］.广东医学，2012，33（7）:917-919.

［10］兰淼，巩丽，李艳红，等.不同脱钙液对骨髓组织切片HE染色效果的对比研究［J］.陕西医学杂志，2010，39（10）:1299-1300.

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1004-2725（2016）05-0368-03

730050甘肃 兰州，甘肃省肿瘤医院病理科

金荣，E-mail:jinrong1024@163.com