季婷 田晨 王云从 刘晗 秦莉 顾金超 宋梦丹 杨小娟 谢小冬

L-选择素基因多态性在2型糖尿病肾病家系中的相关性分析

季婷 田晨 王云从 刘晗 秦莉 顾金超 宋梦丹 杨小娟 谢小冬

目的：初步探讨L-选择素基因rs4987318、rs2229569、rs4656697、rs78261125单核苷酸多态性（SNP）与一家族性2型糖尿病肾病的相关性，为个体化治疗糖尿病肾病提供基础资料。方法：应用聚合酶链式反应（PCR）-基因测序技术检测同一家系中6名糖尿病肾病患者和13名健康成员L-选择素基因多态性。结果：rs4987318位点基因型在该家系中基因型全部为AA，rs2229569位点基因型在该家系中基因型全部为CC，rs4656697位点在该家系中有GG、GC和CC型，患者组基因型频率为GG（50%），GC（50%）对照组基因型频率为GG（61.54%），GC（30.77%），CC（7.69%），应用Fisher精确检验差异无统计学意义（P＞0.05）。rs78261125位点在该家系中有GG和GC，病例组基因型频率为GG（33.33%），GC（66.67%），对照组基因型频率为GG（69.23%），GC（30.77%），应用Fisher精确检验差异无统计学意义（P＞0.05）。结论：L-选择素基因rs4987318位点与rs2229569位点在该家系内无多态性；rs4656697位点与rs78261125位点多态性与该家族二型糖尿病肾病之间未发现相关性。

糖尿病肾病；L-选择素；单核苷酸多态性；家族性

糖尿病是由免疫功能紊乱、遗传因素、微生物感染及精神因素、毒素、自由基毒素等各种致病因子作用于机体后导致的胰岛功能减退、胰岛素抵抗等而引发的蛋白质、糖、脂肪、水和电解质等一系列代谢紊乱的综合征。2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）是糖尿病的常见类型，95%以上的糖尿病患者为2型糖尿病。通常认为2型糖尿病的发病不仅与环境因素有关，而且与遗传因素也有着密切的联系，不同民族和地域在遗传和表型上均有异质性。糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病全身性微血管病变表现之一，临床特征为蛋白尿，渐进性肾功能损害，高血压，水肿，晚期出现严重肾功能衰竭，是糖尿病患者的主要死亡原因之一。目前认为糖尿病肾病的防治侧重于预防，应积极干预其危险因素，因此，了解其发病机制显得尤为重要。

选择素是细胞粘附分子选择素家族的成员之一，为单链跨膜的受体糖蛋白，表达于大多数外周血白细胞的表面。它主要介导白细胞与内皮细胞间的选择性识别、粘附，在淋巴细胞归巢、白细胞炎性渗出等过程中起重要作用。编码L-选择素的基因定位于人类1号染色体长臂上，全长约30 kb，含有10个外显子。国外关于L-选择素基因多态性与疾病关系的研究较多，Kretowski等研究发现L-选择素基因T668C多态性与1型糖尿病相关，Takei等［1］则报道L-选择素单核苷酸多态性与IgA肾病密切相关。

本研究从L-选择素基因多态性与2型糖尿病肾病的相关性入手，根据2型糖尿病肾病家系内的发病情况进行初步探讨，以期为该家系乃至更大范围的人群的个体化治疗提供基础资料。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取宁夏回族自治区一2型糖尿病肾病家系，受试者签署知情同意书后进行相关检查。糖尿病诊断按1999年WHO标准，胰岛细胞抗体和谷氨基酸脱羧酶抗体阴性，无自发酮症倾向。共收集到19位成员，男性10例，女性9例，年龄22～65岁，平均年龄（44±14）岁。其中2型糖尿病患者组6例为DN组，健康成员13例为对照组。

1.2 方法

1.2.1 资料收集。按照统一的测量标准，对每位受试者测量身高、体质量、腰围、臀围；计算体重指数（BMI），腰臀比（WHR）。

1.2.2 DNA的提取。抽取空腹外周静脉血2ml，乙二胺四乙酸二钠（EDTANa2）抗凝，常规酚-氯仿提取法提取DNA。

1.2.3 引物的设计与合成。引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成。见表1。

表1 PCR引物序列及PCR产物片段长度

1.2.4 扩增产物的琼脂糖凝胶电泳。取扩增产物量1微升，2%琼脂糖凝胶（EB染色）电泳，应用凝胶成像系统在紫外灯下观察。

1.2.5 扩增产物测序。测序由苏州金唯智生物科技有限公司完成，结果使用BioEdit Sequence Alignment Editor软件显示。

1.3 统计学方法 应用SPSS19软件分析数据。基因型和等位基因频率采用频率计数法计算，研究对象经Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验是否符合。基因型和等位基因频率比较采用fisher精确检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 rs4656697位点与rs78261125位点PCR产物和测序结果图 rs4656697位点PCR扩增产物片段长度为718bp（如图1）。rs4656697位点扩增产物序列图谱，基因型分别为a:GC，b:GG，c:CC（如图2）。rs78261125位点PCR扩增产物片段长度为680bp（如图3）。Rs4656697位点扩增产物序列图谱，基因型分别为a: GG，b:GC（图4）。

图1 rs4656597的PCR扩增产物电泳图

图2 L-选择素基因rs4656697位点（G/C）测序图

图3 rs7826125的PCR扩增产物电泳图

图4 L-选择素基因rs78261125位点（G7C）测序图

2.2 基因型频率分析 两组L-选择素基因rs4656697位点与rs78261125位点基因频率分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡（p＞0.05）。两位点基因型频率和等位基因频率分布经Fisher精确检验，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 糖尿病肾病组（DN）与对照组SNP多态性的比较［例（%）］

3 讨论

近年来，糖尿病的发病率逐年上升，而且发病年轻化，糖尿病肾病发病率也逐年上升。据调查，糖尿病肾病的发生具有相当强度的家族聚集现象，即一个家系中有3个或3个以上患有糖尿病，说明其发病具有遗传倾向，大多数的糖尿病患者最终不会发生肾脏病变，但一些长期血糖控制良好的患者最后却发生糖尿病肾病，这说明糖尿病肾病有一定的易感性，遗传因素在糖尿病肾病的发病过程中发挥着重要的作用。

有大量实验及临床资料表明，糖尿病继发的血管病变主要是一种慢性血管炎性反应，糖尿病肾病存在炎性细胞浸润和炎症介质水平的升高，有关炎性细胞因子在其中作用的研究也愈发增多，目前已证实细胞间粘附分子-1（ICAM-1）［2］、血管内皮生长因子（VEGF）［3，4］、内皮素-1（ET-l）［5］、血小板活化因子（PAF）［6］、白介素18（IL-18）［7］、肿瘤坏死因子-α［8］等与糖尿病肾病的发病有关，其中粘附分子与糖尿病肾病的关系最为密切。现已证实，糖尿病肾病存在粘附分子表达增加，粘附分子介导的白细胞与血小板、白细胞与内皮细胞之间的相互作用，在炎症反应、血栓形成和组织损伤的过程中有着决定性的作用。

目前，对L-选择素rs2229569，rs4987318基因位点多态性与二型糖尿病易感性关系的研究已经有一些，但是他们在不同的人群中所获得的结果不尽相同。有报道在L-选择素第5外显子区域213位点（rs2229569）处存在C到T的突变，并导致脯氨酸到丝氨酸的替换，可能由此影响其表达水平及生物学活性。夏尊恩［9］等在对中国湖北地区汉族人群L-选择素基因P213S多态性的研究表明此位点上存在PP，PS，SS三种基因型，以PS杂合子最多见，PP纯合子次之，SS纯合子最少见。张阳东［10］等在对2型糖尿病患者rs4987318基因位点多态性和生化指标的研究中报道rs4987318基因多态性可能与2型糖尿病的易患性、患者血脂代谢紊乱和血管炎症的发生有关。在本研究中，在该家系内L-选择素rs4987318基因位点全部为AA型，rs2229569基因位点全部为CC型，说明在该家系内无多态性。分析以上各研究得到结果不同的原因，可能是不同的研究人群具有不同的遗传基础，也有可能掺杂了环境因素对研究的干扰。

本研究中，结果显示，L-选择素rs4656697基因位点在该家系内，GG型在糖尿病肾病患者组与对照组分别为50%、61.54%，GC型50%、30.77%，CC型0%、7.69%，G等位基因频率为75%、76.92%，C等位基因频率为25%、23.08%。基因型和等位基因频率在两组间均无统计学意义（P＞0.05），说明L-选择素rs4656697基因位点多态性与二型糖尿病肾病可能无相关性。rs78261125基因位点在该家系中有GG和GC，病例组基因型频率为GG（33.33%），GC（66.67%），对照组基因型频率GG（69.23%），GC（30.77%），差异无统计学意义（P＞0.05），说明L-选择素rs4656697基因位点多态性与二型糖尿病肾病可能无相关性。但是本研究只选择一个家系，样本量小，今后需要扩大样本量，在多个家系中进行基因多态性与相关性的研究来验证。

综上所述，对于L-选择素基因多态性与2型糖尿病肾病的研究，还有待于继续进行大样本，多中心研究。通过对2型糖尿病肾病遗传学因素的探讨，将会为2型糖尿病肾病的风险预测，诊断及治疗提供一条新的线索和途径。

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Study on the association between a family with type 2 diabetes nephropathy（DN）and the L-selection（SELL）genes polymorphism

Ji Ting1，Tian Chen3，Wang Yuncong1，Liu Han3，Qin Li1，Gu Jinchao1，Song Mengdan2，Yang Xiaojuan2，Xie Xiaodong21.The first Clinical Medical College of Lanzhou University，Lanzhou 730000，China；2.School of Basic Medical Science，Institute of Genetic，Lanzhou University，Lanzhou 730000，China；3.The Second Clinical Medical College of Lanzhou University，Lanzhou 730000，China

Xie Xiaodong，E-mail:18298343353@163.com

Objective:To discussed the association between single nucleotide polymorphisms（SNPs）as rs4987318，rs2229569，rs4656697，rs78261125 in L-selectin（SELL）gene with familial type 2 diabetic nephropathy（DN），to provide basic statistics for individualized treating of diabetic nephropathy.Methods:Four SNPs as rs4987318，rs2229569，rs4656697 and rs78261125 of SELL gene in six patients of DN and thirteen healthy members from a family were analyzed with polymerase chain reaction-gene sequencing technology.Genotype of L-selectin was determined in 6 patients with familial type 2 diabetic nephropathy and 13 healthy controls by polymerase chain reaction-ligase dection reaction（PCR-LDR）technique.Results:The genotype of rs4987318 locus in this family all are AA.The genotype of rs2229569locus in this family all are CC.The genotype of rs4656697locus in this family are GG，GC and CC.Genotype frequencies of patients are GG（50%）and GC（50%），and genotype frequencies of the controls are GG（61.54%），GC（30.77%）and CC（7.69%）.The genotype of rs78261125locus in this family are GG and GC.Genotype frequencies of patients are GG（33.33%）and GC（66，67%），and genotype frequencies of the controls are GG（69.23%）and GC（30.77%）.There was no significant difference in Fisher'sprecise test（P＞0.05）.Conclusion:The SNPS（rs4987318 and rs2229569）in SELL gene have no polymorphism in this family.And the polymorphisms of SELL rs4656697 and rs78261125 have no association with this DN family.

diabetic nephropathy；L-selectin；single nucleotide polymorphisms；family

A

1004-2725（2016）05-0326-04

2014年“本科教学工程”国家级大学生创新创业训练计划项目（项目编号：201410730139）

730000甘肃 兰州，兰州大学第一临床医学院（季婷、王云从、秦莉、顾金超），基础医学院遗传研究所（宋梦丹、杨小娟、谢小冬），第二临床医学院（田晨、刘晗）

谢小冬，E-mail:18298343353@163.com