侯剑伟　张彤　丁越　刘云　刘祥兰

（上海中医药大学教学实验中心，上海201203）

大黄蒽醌类化合物柱色谱分离的教学实验项目设计※

侯剑伟张彤丁越刘云刘祥兰

（上海中医药大学教学实验中心，上海201203）

目的色谱分析实验中柱色谱分离实验是中药学专业学生需掌握的一个实验技能，学生通过该实验掌握实验技能外，还通过该实验掌握色谱中一些常用术语和参数的计算及意义。方法用硅胶柱色谱分离大黄蒽醌类化合物，以硅胶（200～300目）为吸附剂、石油醚：乙酸乙酯（4∶1）为洗脱剂洗脱。结果蒽醌类化合物在洗脱过程中，中能明显分离3个色带，色带间分离度良好。结论以柱色谱分离大黄蒽醌类化合物做为色谱分析中柱层析实验，完全满足实验教学需要。

色谱；大黄；蒽醌类化合物；柱层析；实验教学

色谱分析实验是中药学专业必须掌握的一类实验，其内容主要包括柱层析、薄层色谱层析及色谱类仪器分析实验。学生通过该类实验课程，不仅学习实验的操作技能，更通过该类课程加深仪器分析课程中色谱理论的学习。大黄蒽醌类化合物提取分离实验项目在部分中医药院校有开设，但主要开设在中药化学、天然药物化学课程中。中化类课程侧重利用PH萃取法分离鉴定大黄中游离蒽醌，而大黄分离应用在色谱分析类实验中较少。大黄根茎中主要含有五种蒽醌类化合物，极性由大到小为大黄酸、芦荟大黄素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚。由于结构不同，极性不同，在硅胶柱色谱上的吸附性能也不同，可用硅胶柱色谱法分离。

1　仪器与试剂

石油醚60℃～90℃（分析纯，国药集团化学试剂有限公司），乙酸乙酯（分析纯，国药集团化学试剂有限公司），柱层析用硅胶200～300目（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；硅胶H板（青岛海洋化工有限公司）。样品制备：大黄乙醇提取物：取大黄粉末100 g，加入400 ml乙醇，超声提取30分钟，过滤药材残渣，减压回收乙醇，得到大黄乙醇提取物。大黄乙醇提取物拌硅胶样品：取大黄乙醇提取物，加入3倍量的柱层析用硅胶，加入乙酸乙酯适量复溶，连同硅胶在旋转蒸发仪上蒸干待用。

2　实验步骤

2.1大黄蒽醌化合物的柱色谱分离装柱：取柱内径为1.5 cm的色谱柱一根，长度约30 cm，按柱层析干法装柱，将7 g柱层析硅胶装入色谱柱中，轻轻敲打色谱柱，使之结实备用。上样：将0.2 g左右的苷元硅胶混合物加于硅胶上端，平铺成一薄层，再在上面加入1 cm的石英砂。洗脱：取石油醚：乙酸乙酯（4∶1）的混合溶剂洗脱。大黄蒽醌类化合物在层析柱中显3个色带，由下至上，第一色带为大黄素甲醚与大黄酚的混合物、第二色带为大黄素，第三色带为芦荟大黄素。用量筒收集各色带及空白带，方便记录其体积。

2.2数据记录记录所用硅胶用量（m），初次加入硅胶柱上端洗脱剂的体积（约30 ml）及在色谱柱中高度H0，打开活塞，第一滴洗脱液流出色谱柱时，残留石英砂上端洗脱液高度（H1），色谱柱内径（d），计算死体积（V0），记录洗脱各个色带或空白带的保留体积。用尺量出各色带流出色谱柱时的高度（WR）。记录参数见图1。

图1　大黄蒽醌柱色谱分离示意图

2.3计算和分析本实验学生需掌握柱色谱分离的实验操作步骤，还需结合实验对色谱参数进行计算，计算参数如下：死体积V0：指的是色谱柱中未被固定相占据的空隙体积，对于本实验，即第一次加入色谱柱的流动相体积减去当第一滴洗脱液流出色谱柱时柱上端的洗脱剂体积。数据记录时记录第一次加入洗脱剂时柱上端洗脱剂高度H0，加入的体积V初（约30ml），当第一次洗脱剂流出色谱柱时，色谱柱上端残留洗脱剂高度H1。死体积V0计算公式可简化为：

保留体积VR：从洗脱开始到某组分在柱后出现浓度极大值时流出溶剂的体积。本实验有3个色带，其保留体积VR计算公式为：

调整保留体积VR：扣除死体积后的保留体积。其计算公式为：

理论塔板数nR：色谱柱分离效率的指标。其计算公式为：

分配系数K：溶质在两相中的迁移能力及分离效能

2.4大黄蒽醌化合物薄层色谱鉴定取大黄酚、大黄素、芦荟大黄素标准品，甲醇分别配制成0.5 mg/ml溶液。吸取上述三种对照溶液及收集到的3个色带分别点于同一硅胶H薄层板上，以石油醚（30～60℃）一甲酸乙酯一甲酸（15∶5∶1）的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视［1］。

4　大黄苷元提取物制备考察

大黄苷元提取一般所用方法为甲醇加热回流，或三氯甲烷回流提取［2-3］。所用试剂量大，步骤繁琐，本文采用乙醇超声提取的方法，并对这三种提取方法进行了提取率、耗时、实验结果进行了考察，结果见表1。

表1　不同提取方法对实验结果的影响

由表1可见虽然甲醇回流与氯仿回流提取率较高，但两者耗时较长，步骤繁琐，试剂用量较大，有一定的毒性，而乙醇超声耗时短，试剂用量小，无毒。对实验结果无影响。实际每组学生用量约0.06 g提取物浸膏粉，用量较少。因此选用乙醇超声提取大黄苷元混合物，大大简化实验准备工作量。

5　洗脱剂体系的考察

原大黄蒽醌柱色谱分离实验洗脱剂体系为三氯甲烷：丙酮（95∶5），三氯甲烷对心、肝、肾有损害，为可疑致癌物［4］，在倡导绿色化学的今天，少用及不用对环境、人体危害大的试剂已成了共识，因此考察了几个洗脱剂体系替代掉三氯甲烷，以分离色带、分离度、实验耗时作为考察指标，考察结果见表2

表2　不同洗脱剂对实验结果的考察

由表2可见，各色带间的分离度都能达到＞1.5，能够完全分离。用三氯甲烷：丙酮和二氯甲烷：丙酮体系只能分离2个色带，环已烷：乙酸乙酯体系耗时太长，不适合作为教学实验，因此选用石油醚：乙酸乙酯体系。

6　洗脱剂比例及硅胶用量的考察

对不同比例石油醚：乙酸乙酯洗脱剂及硅胶用量进行优化，以分离度与实验耗时作为考察指标结果如下

表3　洗脱剂比例及硅胶用量的考察

从表3的结果来看，硅胶用量降至7 g后，实验耗时能满足实验教学需要，色带间均能完全分离。根据实际教学时间安排，选用石油醚：乙酸乙酯4∶1硅胶用量为7 g的条件对大黄蒽醌提取物进行分离。

7　结语

选用大黄作为作为通过柱层析实验学习色谱理论的实验教学其优点：大黄蒽醌类化合物其颜色黄色，在该实验中，能明显的在色谱柱中显示3个色带，学生可凭肉眼观察，进行数据的记录并进行相关色谱参数的计算。该实验所用试剂安全低毒，用量少，分离产物可用作下一步实验的材料，实验契合绿色化学5R的理念。该课程可灵活衔接其他实验项目，方便开设综合类实验项目。分离的产物可用过薄层层析、高效液相色谱进行纯度的鉴定等。该实验实验时间适中，从教师讲解到学生完成实验需时150～180 min，满足本专科学校一次实验课的时间。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典:一部［S］.2015:22.

［2］张海晖，裘爱泳，等.超声技术提取大黄蒽醌类成分［J］.中成药，2005，27 （9）:1075.

［3］刘建华，韩立强，等.提取方法对大黄蒽醌类成分及抗氧化活性的影响［J］.安徽农业科学，2008，36（22）:9484.

［4］曹励，陈瑛，等.氯仿对机体免疫功能的毒性作用［J］.西安交通大学学报：医学版，2003（4）.

A Teaching Experiment Project Design of Rhubarb Anthraquinones Compounds Column Chromatography Separation

HOU Jianwei，ZHANG Tong，DING Yue，LIU Yun，LIU Xianglan
（Experimental Center for Teacher&Learning，Shanghai University of TCM，Shanghai 201203，China）

Objective The column chromatography separation in chromatographic analysis experiment is one of majors of Chinese materia medica students to master the experimental skills.Through the experiment，students grasp the skill of experiment，and through the experiment，students master some common terms in chromatography and parameter calculation and significance.Methods Using silica gel column chromatography separation of rhubarb anthraquinone compounds，silica gel（200-300 mesh）was used as adsorbent，petroleum ether，ethyl acetate（4：1）was used as the eluent elution.Results The anthraquinone compounds in the process of elution can clearly separate 3 ribbons，and ribbon between the separation degree is good.Conclusion By column chromatography separation of rhubarb anthraquinone compounds as a chromatographic column chromatography in the analysis of the experiment fully meets the needs of the experiment teaching.

chromatography；rhubarb；anthraquinones compounds；column chromatography；experimental teaching

10.3969/j.issn.1672-2779.2016.18.059

1672-2779（2016）-18-0133-02

（本文编辑：李海燕本文校对：丁越2016-07-11）

上海中医药大学教学课程建设项目资金支持（No：SHUTCM2015ZDKCJS006，SHUTCM2015KCJS043）