刘海宁， 朱新宇， 吴　昊， 陈玉琢， 英和娜拉， 刘韬韬

复旦大学附属中山医院消化内科，上海　200032



·论著·

胃癌患者血清miRNA-223的表达水平及其诊断价值

刘海宁△， 朱新宇△， 吴昊， 陈玉琢， 英和娜拉， 刘韬韬*

复旦大学附属中山医院消化内科，上海200032

目的： 探讨胃癌患者血清中miRNA-223的表达水平及其诊断价值。方法： 采用实时定量PCR法检测50例胃癌患者和50名健康对照者血清miRNA-223的表达量，分析miRNA-223与胃癌临床病理参数的关系。构建受试者工作特征(ROC)曲线，比较miRNA-223与癌胚抗原(CEA)的诊断效能。结果： 胃癌患者血清miRNA-223水平高于健康对照组(P<0.05)。ROC曲线显示，miRNA-223诊断胃癌的曲线下面积(AUC)达0.636(95%CI 0.526～0.746)，灵敏度、特异度分别为48%、82%；miRNA-223联合CEA诊断胃癌的AUC达0.769(95%CI 0.675～0.862)，灵敏度、特异度分别为70%、78%。结论： miRNA-223联合CEA有助于胃癌的诊断。

胃癌；miRNA-223；诊断价值

胃癌是全球范围内发病率占第4位的恶性肿瘤，在东亚地区的发病率远高于其他地区[1]。多数胃癌患者在明确诊断时已为晚期，预后较差。因此，寻找胃癌的早期诊断标志物对于提高其早期诊断率与降低病死率显得尤为重要。微小RNA(microRNA)是一类非编码的单链RNA，包含20～24个核苷酸，可精细调控基因的表达。血液中多种microRNA可以作为胃癌的早期诊断标志物。miRNA-223在多种恶性肿瘤中表达增加。本研究通过检测胃癌患者及健康对照血清中miRNA-223的表达量，评价其对胃癌的诊断效能。

1　资料与方法

1.1一般资料选择2015年7月—9月在复旦大学附属中山医院就诊的胃癌患者。所有病例均经病理证实，且均无手术或放化疗史。50例患者中，男性33例，女性17例；年龄(64.5±10.0)岁。诊断依据胃镜或手术后病理活检结果。TNM分期依据国际抗癌联盟第7版标准，Ⅰ期13例，Ⅱ期13例，Ⅲ期18例，Ⅳ期6例。病理分期以病变仅侵及黏膜及黏膜下层为早期胃癌[2]，相当于T1N0M0期。本研究中，早期胃癌12例，进展期胃癌38例。另选择2015年4月在复旦大学附属中山医院体检中心体检的50名健康志愿者作为对照，其中，男性29例，女性21例；年龄(34.8±7.2)岁；排除肿瘤性疾病。本研究通过医院医学伦理委员会审核，所有患者及健康志愿者均知情同意并填写知情同意书。

1.2方法

1.2.1血清收集及DNA提取清晨，空腹条件下，用SST血清分离胶管(BD公司，美国)抽取外周静脉血约3 mL，血清析出后以1 000 ×g离心，吸取上层血清保存至-80℃冰箱。秀丽隐杆线虫miRNA-39(cel-miRNA-39)作为外参，加入100 mL血清中。用miRNA提取分离试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取血清中总RNA。

1.2.2miR-223定量检测用cDNA第一链合成试剂盒和miRNA荧光定量检测试剂盒进行反转录及实时定量PCR检测[试剂盒及引物均购自天根生化科技(北京)有限公司]。miR-223序列为5′-UGUC AGUUUGUCAAAUACCCCA-3′。实时定量PCR仪购自Applied Biosystems公司(7500型，美国)。1.2.3Ct值的处理PCR反应结束后，融解曲线显示引物特异性良好。以Applied Biosystems 7500型实时定量PCR仪默认的阈值为标准，可得到目的基因在该样本中扩增的Ct值。所有样品均设3个副孔，取平均Ct值。相对表达量以cel-miR-39为外参，以log10(2-ΔCt)方法计算miRNA-223的相对表达量[3]。1.2.4血清癌胚抗原(CEA)检测全自动化学发光免疫分析仪测定血清标本的CEA浓度。CEA<50 ng/L为正常。

1.3统计学处理采用Stata 12.0及SPSS 19.0软件进行数据分析。胃癌组与健康对照组的miRNA-223表达量采用成组两样本t检验，CEA浓度采用成组两样本Wilcoxon秩和检验。胃癌患者miRNA-223表达量与性别的关系采用成组两样本Wilcoxon秩和检验，与有无淋巴结转移、TNM分期、病理分期的关系采用成组两样本t检验，与年龄、肿瘤直径的关系采用Pearson线性相关分析。用受试者工作特征(ROC)曲线及其曲线下面积(AUC)评估miRNA-223及CEA的诊断效能。所有检验均为双侧检验。检验水准(α)为0.05。

2　结　果

2.1两组血清miRNA-223表达水平及CEA浓度的比较胃癌组患者血清miRNA-223的表达量为3.64±0.62，健康对照组为3.35±0.54，两组差异有统计学意义(t=-2.518，P=0.013)。胃癌组血清CEA中位浓度为2.2 ng/L，健康对照组中位浓度为1.2 ng/L，两组差异有统计学意义(Z=-4.264，P<0.001)。两组miRNA-223的表达水平见图1。

图1　胃癌组及健康对照组血清miRNA-223表达水平

2.2胃癌患者血清miRNA-223表达水平与临床病理参数的相关性胃癌患者血清miRNA-223表达水平与性别、年龄、肿瘤大小、有无淋巴结转移、TNM分期、病理分期无关(表1)。胃癌患者不同TNM分期的血清miRNA-223表达水平见图2。

表1　胃癌患者miRNA-223的相对表达量与

图2　胃癌患者不同TNM分期血清miRNA-223的表达水平

2.3血清miRNA-223的诊断价值ROC分析(图3)显示：miRNA-223诊断胃癌的AUC为0.636(95%CI 0.526～0.746)；当临界阈值为3.71时，约登指数最高，诊断胃癌的灵敏度为48%、特异度为82%、阳性预测值为72.7%、阴性预测值为61.2%。以CEA<50 ng/L作为正常参考值，CEA诊断胃癌的灵敏度为16%，特异度为100%。miRNA-223联合CEA诊断胃癌的AUC达0.769(95%CI 0.675～0.862)。联合诊断的计算式为：0.719×miRNA-223+0.874×CEA。当临界阈值为4.16时，约登指数最高，两者联合诊断胃癌的灵敏度为70%、特异度为78%、阳性预测值为76.1%、阴性预测值为72.2%。

图3　miRNA-223和(或)CEA诊断胃癌的ROC曲线

3　讨　论

miRNA-223在多种恶性肿瘤患者血清中表达量升高，如胃癌[4]、结直肠癌[5]、肺癌[6]。研究[7]表明，肿瘤相关细胞(如树突状细胞、巨噬细胞、T细胞)可通过释放含miRNA-223的外泌体来调控肿瘤细胞的增殖与侵袭。Zhou等[8]的研究表明，miRNA-223可通过F框/WD-40域蛋白7( FBXW7)调控胃癌细胞周期，促进其对顺铂的耐药。

本研究进一步表明，胃癌患者的血清miRNA-223表达水平较健康人显著升高，为健康人的1.95倍。miRNA-223表达水平与性别、年龄、肿瘤大小、有无淋巴结转移、TNM分期、病理分期无关，提示该指标作为分期、化疗后或术后疗效预测、预后标志物有局限性。miRNA-223作为诊断标志物的曲线下面积为0.636，诊断效能最高时灵敏度为48%，特异度为82%。需要指出，本研究胃癌组与健康对照组年龄有显著差异(P<0.001)，但Zhou等[8]的研究与本研究均认为，血清miRNA-223表达水平与年龄无关。

CEA是传统的胃癌诊断标志物，但其在多种消化系统恶性肿瘤、肺癌中均可能升高，因此诊断特异度不高，且易受到吸烟、感染等影响。本研究以<50 ng/L作为CEA的正常参考值，CEA的灵敏度仅为16%，特异度为100%。CEA的特异度与既往研究不符，原因可能在于：由于其他癌症人群比例较健康人群过低而未纳入对照组，且<50 ng/L为95%健康人群的取值范围，而本研究仅纳入50例健康人为对照。联合miRNA-223与CEA可使诊断的ROC曲线下面积上升至0.769，诊断效能最高时灵敏度为70%、特异度为78%。因此，miRNA-223联合CEA可用于胃癌的诊断，并优于单独应用miRNA-223或CEA。

然而，miRNA-223及CEA水平在多种恶性肿瘤中升高，使其诊断胃癌的特异度降低，因此需先通过影像学检查进行定位诊断。

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[本文编辑]姬静芳

Diagnostic value and expression of serum miRNA-223 in patients with gastric cancer

LIU Hai-ning△, ZHU Xin-yu△, WU Hao, CHEN Yu-zhuo, Enkhnaran Bilegsaikhan, LIU Tao-tao*

Department of Gastroenterology, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China

Objective： To discuss the expression and diagnostic value of miRNA-223 in patients with gastric cancer. Methods： The expression of serum miRNA-223 was detected in 50 patients with gastric cancer and 50 healthy controls by using real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR). The relationship of miRNA-223 and clinicpathological parameter of gastric cancer was analyzed. The receiver operating curve (ROC) was constructed and the diagnostic value of miRNA-223 and carcinoembryonic antigen (CEA) was compared. Results： The serum miRNA-223 in patients with gastric cancer was significantly higher than control group. The ROC indicated that area under the ROC curve (AUC) of miRNA-223 was 0.636 (95%CI 0.526-0.746) with sensitivity of 48% and specificity of 82% whileAUCof combination of miRNA-223 and CEA was 0.769 (95%CI 0.675-0.862) with sensitivity of 70% and specificity of 78%. Conclusions： Combining miRNA-223 and CEA can be used to diagnosis gastric cancer.

gastric cancer；miRNA-223；diagnostic value

2016-05-29[接受日期]2016-08-01

刘海宁,博士生.E-mail: lhn0116@126.com;朱新宇, 主管护师. E-mail: zhu.xinyu@zs-hospital.sh.cn

Corresponding author). Tel: 021-64041990-2070, E-mail: liu.taotao@zs-hospital.sh.cn

10.12025/j.issn.1008-6358.2016.20160638

R 735.2

A

△共同第一作者(Co-first authors).