韩宵，朱磊，闫春风，翁慧沥，董海荣*

(1.承德医学院 中药研究所，河北 承德 067000；2.颈复康药业集团有限公司，河北 承德，067000；3.河北省中药新辅料工程技术研究中心，河北 承德 067000)

多指标综合加权评分法优选人参醇提工艺

韩宵1，2，3，朱磊2，3，闫春风2，3，翁慧沥2，3，董海荣2，3*

(1.承德医学院 中药研究所，河北 承德067000；2.颈复康药业集团有限公司，河北 承德，067000；3.河北省中药新辅料工程技术研究中心，河北 承德067000)

目的：通过多指标综合加权评分法优选人参醇提的最佳取工艺，确定最佳提取工艺参数。方法：采用正交试验法考察乙醇浓度、提取时间、提取次数、溶剂用量及其交互作用对人参醇提工艺的影响。应用紫外分光光度计(UV)法测定人参总皂苷和蒸发检测器-高效液相色谱法(HPLC-ELSD)测定人参皂苷Rg1、Re和Rb1的含量。并以人参总皂苷得率，人参皂苷Rg1、Re转移率，人参皂苷Rb1转移率，人参总皂苷得率和出膏率为指标，采用加权评分法进行综合评判。结果：确定最佳醇提工艺为70%乙醇6倍量，提取3次，每次2h。结论：该法简单、易行、重复性好，适用于工业化生产。

人参；人参皂苷Rg1；人参皂苷Re；人参皂苷Rb1；人参总皂苷；正交试验法

人参为五加科植物人参PanaxginsengC.A.Mey.的干燥根，具有大补元气、复脉固脱、补脾益肺、安神益智的功能[1]。人参具有增强记忆力、提高免疫力、改善心血管、延缓衰老、抗肿瘤等多种药理作用[2-3]。其主要活性成分为多种人参皂苷、糖类、挥发油、有机酸、氨基酸、维生素以及多种微量元素。人参皂苷的活性最强，具有抗肿瘤、抗衰老、抗心律失常和益智的作用[4-6]。本研究采用正交试验法[7-11]，以人参皂苷Rg1、Re转移率，人参皂苷Rb1转移率，人参总皂苷得率和出膏率为指标，进行人参醇提工艺研究，实现人参醇提工艺工业化生产。

1 仪器与材料

Agilent1260高效液相色谱仪；Alltech3300蒸发光散射检测器；AE240十万分之一电子分析天平(瑞士梅特勒)；UV-2401PC紫外分光光度仪(日本岛津)；人参皂苷Rg1、Re、Rb1对照品(中国食品药品检定研究院，批号分别为110703-201027，110754-200822，110704-201223)；乙腈为色谱纯；其他试剂为分析纯。

人参药材由颈复康药业集团有限公司提供，经颈复康药业集团有限公司药物研究院董海荣工程师鉴定为正品。

2 方法与结果

2.1人参皂苷Rg1、Re、Rb1的含量测定

2.1.1 色谱条件 色谱柱：Shim-pack VP-ODS柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈(A)-水(B)梯度洗脱(0～20 min，19.5% A；20～32 min，27%A；32～40 min，32% A；40～50 min，33% A；50～60 min，38% A；60～70 min，38% A)；流速：1.0 mL·min-1；柱温：25 ℃；ELSD参数：漂移管温度为85 ℃，气体流速为1 L·min-1，增益为2；进样量为10 μL[12-14]。

2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取人参皂苷Rb1、Rg1、Re对照品适量，加甲醇制成质量浓度分别为0.928 7、0.170 6、0.452 1 mg·mL-1的混合对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备 取人参提取液1 g，精密称定，加入80%甲醇50 mL，回流提取2 h，滤过，蒸干，残渣加水15 mL，微热使其溶解。用水饱和的正丁醇振摇萃取4次(15、15、10、10 mL)，合并正丁醇萃取液，用氨试液洗涤2次，每次15 mL，弃去氨试液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至5 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得[12-14]。

2.1.4 线性关系考察 精密量取对照品溶液，分别进样4、6、8、10、15、20 μL，按2.1.1项下色谱条件，进样量(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，进行线性回归，得回归方程，人参皂苷Rg1：Y=1.529 8X-2.424 9(r=0.999 6)；人参皂苷Re：Y=1.284 2X-1.332 5(r=0.999 1)；人参皂苷Rb1：Y=1.359 3X-1.614 8(r=0.999 7)。结果表明，人参皂苷Rb1、Rg1、Re分别在3.715～18.574、0.682～3.412、1.808～9.042 μg线性关系良好。

2.1.5 精密度考察 精密吸取2.1.2项下制备的对照品溶液10 μL，按2.1.1项下色谱条件分析，连续进样6次，测定峰面积，结果人参皂苷Rb1、Rg1、Re峰面积 RSD值分别为1.02%、1.73%、1.56%，表明仪器精密度良好。

2.1.6 稳定性试验 取同一供试品溶液，按2.1.1项下色谱条件，分别于0、2、4、6、8、10、12、24 h进样，测定人参皂苷Rb1、Rg1、Re的峰面积，计算峰面积RSD分别为0.25%、0.75%、0.43%。结果表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.1.7 重复性试验 取同一批人参提取液，按2.1.3项下方法，平行制备6份供试品溶液，并按2.1.1项下色谱条件分析，结果人参皂苷Rb1、Rg1、Re含量的RSD分别为1.78%、1.97%、1.88%。表明该方法重复性良好。

2.1.8 加样回收试验 取已知含量的人参提取液适量，精密称取6份，每份约0.5 g，精密加入对照品溶液3 mL，按2.1.3项下的方法制备供试品溶液，并按2.1.1项下色谱条件进样测定，计算回收率。结果人参皂苷Rb1、Rg1、Re的平均回收率分别为100.5%、99.5%、97.7%，RSD分别为1.67%、1.46%、1.53%。

2.1.9 样品含量测定 取正交试验1～18号样品按2.1.3项下方法制成供试品溶液，按2.1.1项下方法测定，计算人参皂苷Rb1、Rg1、Re的含量。

2.2人参总皂苷的含量测定

2.2.1对照品溶液的配制 精密称取人参皂苷Re对照品，加甲醇定容，配制成质量浓度为1mg·mL-1的溶液，作为对照品溶液。

2.2.2供试品溶液的制备 取人参提取液100mg，精密称定，置锥形瓶中，精密加入25mL甲醇，超声处理(250Hz，490W)，放置室温，甲醇补重，滤过，即为供试品溶液。

2.2.3线性关系考察 精密移取对照品溶液20、40、80、120、160、200μL，分别置具塞试管中，氮气吹干溶剂，加入1%香草醛高氯酸试液0.5mL，置60℃恒温水浴上，充分混匀后，加热15min，立即用冷水冷却2min，加入77%硫酸溶液5mL，摇匀；以试剂作空白，消除气泡后，于540nm处测定吸光度(A)，以A为纵坐标，浓度为横坐标，得回归方程Y=3.6998X-0.0123(r=0.9998)，线性范围为21.321～213.21μg。

2.2.4精密度试验 精密吸取对照品溶液80μL，加入具塞试管中，氮气吹干溶剂，按2.2.3项下方法处理，于540nm处重复测定6次，计算A值RSD为1.34%，表明仪器精密度良好。

2.2.5重复性试验 取同一批人参提取液的6份供试品溶液各80μL，按2.2.3项下方法处理，于540nm处测定A值，计算RSD为1.77%，表明该方法重复性良好。

2.2.6稳定性试验 精密吸取同一供试品80μL，按2.2.3项下方法处理，分别在10、20、30、45、50、60min，测定540nm处A值，计算RSD为1.28%，表明供试品溶液在60min内稳定。

2.2.7加样回收试验 取已知含量的人参提取液50mg，置于锥形瓶中，共6份，各精密加入人参皂苷Re对照品1mL，按2.2.3项下方法处理，于540nm处测定A值，结果平均回收率为100.2%，RSD为1.27%，表明该方法测定结果准确可靠。

2.2.8样品含量的测定 取正交试验1～18号样品按2.2.2项下方法制成供试品溶液，按2.2.3项下方法处理，测定540nm处A值，计算人参总皂苷含量。

2.4人参乙醇回流提取工艺的优选

2.4.1正交试验 根据单因素试验的结果，本研究确定采用L18(37)正交表，对乙醇浓度(A)、提取时间(B)、提取次数(C)、溶剂用量(D)4个试验因素进行考察，并考察因素A与B、C的交互作用的影响。其提取工艺因素水平表见表1。取30g人参药材(1～2cm段)18份，按照正交试验因素水平表操作，加热回流，合并提取液并浓缩回收乙醇，得浸膏提取物备用。

表1 因素水平表

2.4.2 正交试验结果及方差分析 以人参皂苷Rg1、Re转移率(Ⅰ)、人参皂苷Rb1转移率(Ⅱ)、人参总皂苷得率(Ⅲ)和出膏率(Ⅳ)为指标，采用加权评分法进行综合评分，优选人参醇提工艺。转移率或得率最高值为100分，最低值为0分。以转移率或得率为横坐标，得分为纵坐标，将最高、最低两点带入，得人参皂苷Rg1、Re、Rb1转移率和人参总皂苷得率三者的直线方程分别为Y=2.656 0X-135.511 3；Y=2.554 9X-135.385 8；Y=21.459 2X-97.424 9，将正交表中各个转移率或得率带入，得到相应的分值。出膏率最低值为100分，最高分为0分，以出膏率为横坐标，得分为纵坐标，将最高、最低两点带入，得直线方程为Y=-20.491 8X+261.885 2，将正交表中各个转移率带入，得到相应的分值。权重系数依次为0.4、0.3、0.2、0.1，综合评分=Ⅰ得分×0.4+Ⅱ得分×0.3+Ⅲ得分×0.2+Ⅳ得分×0.1。试验结果及综合见表2。采用spss 20软件对正交试验结果进行分析，方差分析结果见表3。

表2 正交试验结果表

表2(续)

据正交试验结果表极差R值大小表明，影响人参醇提工艺因素排序为C>A>B>AC>E>D。在给定的水平条件下，各因素对提取效果的影响情况为A2>A3>A1、B3>B2>B1、C3>C2>C1、D1>D3>D2。因素A和C对人参醇提工艺影响较大，因素A、C、B和因素A与因素C的交互作用对人参醇提工艺影响较大，而因素D的影响小于E，可以认为是由于误差引起的。

表3 方差分析表

注：F0.01(2，5)=13.27；F0.05(2，5)=5.79。

由方差分析表来看，因素C对人参醇提工艺影响差异有统计学意义(P<0.01)，因素A对人参醇提工艺影响差异有统计学意义(P<0.05)，因素B和D的影响差异无统计学(P>0.05)。故从大生产降低能耗、节约成本考虑，确定最佳提取条件为A2B1C3D1，即70%乙醇，6倍量，提取2 h，提取3次。

2.4.3 验证试验 按优选的最佳提取工艺A2B1C3D1，取300 g人参(1～2 cm段)进行3次验证试验，见表4。结果表明工艺稳定，重复性好。

表4 验证试验结果

3 讨论

人参所含的化学成分很复杂，人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd、Rf等为其主要活性成分；2015版《中华人民共和国药典》中人参药材[8]含量测定项下以人参皂苷Rg1和Re的总量及人参皂苷Rb1的含量来评价其质量；人参皂苷为紫外末端吸收，采用203nm，乙腈-水梯度洗脱检测，存在基线漂移、干扰等问题。因此本试验采用HPLC-ELSD法测定人参皂苷Rb1、Re、Rg1的含量，以人参皂苷Re、Rg1、Rb1转移率为主要指标来优选人参醇提工艺。并采用人参总皂苷得率和出膏率为次要指标来更全面优化醇提工艺，为日后优化其制剂工艺奠定基础。

人参醇提正交试验结果表明，乙醇浓度和提取次数为人参醇提工艺的主要影响因素，提取时间和溶剂用量的影响不明显。故在工业化生产时为节约生产成本，选用6倍量提取2h。最终优选工艺为A2B1C3D1，即6倍量70%乙醇，提取2h，提取3次。

人参提取工艺的方法有渗漉提取、回流提取、超声提取等。人参回流提取较渗漉提取有生产周期短、醇用量小等优点；较超声提取有装置简单、成本低等优点，工业化生产中使用普遍。本试验研究醇提工艺的最佳工艺，可应用于人参及其制剂的生产中。

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OptimizationofEthanolRefluxExtractionTechniqueforPanaxginsengbyMulti-indexComprehensiveWeightedScoreEvaluation

HANXiao1，2，3，ZHULei2，3，YANChunfeng2，3，WENGHuili2，3，DONGHairong2，3*

(1.InstituteofChineseMateriaMedicaofChengdeMedicalCollege，Chengde067000，China；2.JingfukangPharmaceuticalGroupCo，Chengde067000，China；3.NewMaterialsEngineeringTechnologyCenterofTCMofHebeiProvince，Chengde067000，China)

Objective：To optimize ethanol reflux optimal extraction technique forPanaxginsengand confirm the optimum extraction process parameters by multi index comprehensive weighted score evaluation.Methods：Orthogonal experiment method was applied to investigate ethanol concentration，extraction time，extraction times，solvent consumption and their interaction effects on ginseng alcohol extraction process.The total ginseng saponins was determined by UV and the content of ginsenoside Rg1，Re and Rb1were determined by HPLC-ELSD.With transfer rate of Rg1and Re ginsenosides,ginsenoside Rb1,tatal ginseng saponin yeild and the extract rate as the index，the extraction was comprehensive evaluated by using the weighted scoring method.Results：The optimum factors was6times of70% ethanol，refluxing and extracting for2h，for3times.Conclusion：The optimized extraction process is simple，easy，with good reproducibility and suitable for industrial production.

Panaxginseng；ginsenoside Rg1；ginsenoside Re；ginsenoside Rb1；orthogonal design

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.1.016

2015-10-25)

*

董海荣，工程师，研究方向：中药新药研发；Tel：(0314)2292392，E-mail：donghairong312@163.com