李红艳，张江华，张惠，陶震宇，杨静娴，康廷国*

(1.辽宁中医药大学，辽宁 大连 116600；2.大连工业大学，辽宁 大连 116034；3.长春中医药大学 附属医院，吉林 长春 130117)

人参总蛋白的酶解及氨基酸含量测定△

李红艳1，张江华2，张惠3，陶震宇1，杨静娴1，康廷国1*

(1.辽宁中医药大学，辽宁 大连116600；2.大连工业大学，辽宁 大连116034；3.长春中医药大学 附属医院，吉林 长春130117)

目的：比较人参蛋白酶解前后成分的变化，以探讨人参蛋白在体内发挥作用的最终活性物质。方法：采用胃蛋白、胰蛋白酶及双酶(胃蛋白酶与胰蛋白酶联合)水解人参蛋白，采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测蛋白及多肽含量，采用高效液相色谱(HPLC)分析氨基酸组成。结果：SDS-PAGE检测结果显示，人参蛋白经胃蛋白酶水解后，仅出现分子量5000左右的高浓度、低分子量蛋白条带；经胰蛋白酶水解后，出现多条蛋白带，但浓度较水解前低；经双酶水解后，蛋白条带显示与胃蛋白酶接近。HPLC检测结果显示，人参蛋白经胃蛋白酶、胰蛋白酶及双酶水解后，氨基酸种类变化不大，含量明显减少。结论：人参蛋白酶解后转变为多肽及少量氨基酸。

人参蛋白；胃蛋白酶；胰蛋白酶；氨基酸

人参蛋白是人参主要药效物质之一，目前已被证明具有抗氧化[1-2]、增强免疫[3]、神经保护[4]等药理活性。这些活性为人参蛋白的抗衰老研究提供了药理学基础，然而，蛋白质为大分子物质，目前研究认为其只有在体内转变为小肽或氨基酸才能被吸收，因此，尽管作者前期及目前的研究均表明人参蛋白具有一定的体内外药理活性，但关于人参蛋白在体内发挥药效的最终物质尚有待深入研究。本论文采用体外酶解法，应用胃蛋白酶、胰蛋白酶及双酶联合水解人参蛋白，并测定水解度，同时对水解前后样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测、自由基清除率测定及氨基酸含量分析，比较水解前后样品中蛋白、氨基酸差异及抗氧化活性差异，为人参蛋白的体内药动学研究奠定基础。

1 材料与仪器

1.1材料

人参蛋白，长春中医药大学研发中心生物工程实验室提供(纯度：70%)；丙烯酰胺、过硫酸铵、N，N-甲叉双丙烯酰胺、十二烷基硫酸钠(SDS)、考马斯亮蓝R250、溴酚蓝(德国sigma公司)；三羟甲基氨基甲烷(Tris)、β-巯基乙醇(美国Genview公司)；TEMED(美国Amresco公司)；胰岛素(北京鼎国昌盛生物技术有限公司)。

1.2仪器

Elite-AAK氨基酸分析系统(大连依利特分析仪器有限公司)；Tanon4100型凝胶成像分析系统(上海天能科技有限公司)；165-8001型小型垂直电泳槽，Powerpac型电泳仪(美国伯乐公司)；AR2140电子分析天平(METTLE公司)；PHS-3E台式精密算度计(上海精密科学仪器有限公司)。

2 方法

2.1胃蛋白酶酶解

依据文献[5-6]，采用单因素试验考察不同pH(pH1.0、pH1.4、pH1.6、pH1.9)、不同水解时间(1、2、3、4、5h)、不同酶与底物比(1000、2000、3000、4000、5000U·g-1)和不同底物浓度(2%、4%、6%、8%、10%)下人参蛋白的水解度(甲醛滴定法)及自由基清除率(SOD活性，邻苯三酚自氧化法[7])，优选最佳酶解条件。

2.2胰蛋白酶酶解

依据文献[8-9]，采用单因素试验考察不同pH(pH7.0、pH7.5、pH8.0、pH8.5、pH9.0)、不同水解时间(1、2、3、4、5、6h)、不同酶与底物比(1000、2000、3000、4000、5000U·g-1)和不同底物浓度(2%、4%、6%、8%、10%)下人参蛋白的水解度及自由基清除率[7]，优选最佳酶解条件。

2.3双酶水解

按照优选出的酶解条件，于胃蛋白酶水解后，再加入胰蛋白酶进行水解。具体做法为：称取人参蛋白粉1.500g，溶于15mL蒸馏水中，搅拌至充分溶解后，用1mol·L-1盐酸调节pH至1.6，然后放入恒温水浴锅，于37℃温浴5min，迅速加入适量胃蛋白酶(酶与底物比为3000U·g-1)，振荡水解3h。水解结束后，立即100℃灭活10min，待冷却至室温后，用1mol·L-1氢氧化钠(NaOH)溶液调节pH至8.5，加入适量胰蛋白酶(酶与底物比为1000U·g-1)，于55℃水解5h，反应过程中以0.1mol·L-1NaOH溶液维持溶液pH恒定，酶解液100℃水浴灭活15min，3500r·min-1低温离心15min后，取上清液，置-20℃冰箱保存，即得双酶水解液。

2.4SDS-PAGE

上述人参蛋白(0.1 g·mL-1)及其酶解液采用SDS-PAGE进行分子量检测，每个样品上样15 μL。采用分离胶浓度为15%、电压为120 mV；浓缩胶浓度为5%、电压为90 mV。电泳结束后用考马斯亮蓝R250染色，最后用脱色液甲醇-水-冰乙酸(4.5∶4.5∶1)脱色至背景清晰[10]。

2.5氨基酸检测

精密称定人参蛋白冻干粉0.25g，加3mL6mol·L-1盐酸，110℃水解24h，水解后样品于80℃水浴蒸干，用衍生缓冲液洗涤蒸发皿，并转入25mL容量瓶中，备用。另取人参蛋白经胃蛋白酶、胰蛋白酶及双酶水解后的上清液各5mL(均相当于人参蛋白0.5g水解液)，用少量乙腈反复多次沉淀以除去未水解的蛋白质，分别记作胃蛋白酶水解液、胰蛋白酶水解液和双酶水解液(避光操作，终体积各8mL)，分别加衍生缓冲液定容至25mL容量瓶。精密量取氨基酸对照品溶液和样品溶液各5mL，置25mL棕色容量瓶中，加入衍生化试剂5mL，混合，于60℃水浴中避光反应1h，反应完毕，取出冷却至室温，加入平衡缓冲溶液稀释到刻度，混匀，HPLC进样前用0.45μm滤膜过滤。试剂配制及流动相梯度设定参照文献[11]。

3 结果

3.1胃蛋白酶解条件优选

采用不同条件胃蛋白酶水解人参蛋白，并测定水解度和自由基清除率，结果见图1a、1b、1c、1d。

图1 胃蛋白酶不同水解条件下人参蛋白的水解度和自由基清除率测定

图1结果表明，人参蛋白在不同pH条件下，经胃蛋白酶水解后，水解度与自由基清除率不同。其中，pH1.6时水解度最大，pH1.0时自由基清除率最高，综合考虑，选择pH1.6为最适pH(见图1a)。在pH1.6条件下，分别采用胃蛋白酶水解不同时间，结果表明，水解3h时，水解度和自由基清除率均最大，因此选择水解3h为最佳水解时间(见图1b)。采用不同浓度(酶与底物比)胃蛋白酶，分别于pH1.6条件下水解人参蛋白(底物)3h，结果表明，胃蛋白酶浓度为2000U·g-1时水解度最大，3000U·g-1时自由基清除率最大，综合实验结果，选择酶与底物比3000U·g-1(3000∶1)为最佳比例(见图1c)。采用不同底物即GP浓度，于pH1.6，酶浓度3000U·g-1条件下，水解3h，结果表明，底物浓度为10%，即GP0.1g·mL-1时，水解度最大；底物浓度为8%时自由基清除率最大。由于10%底物浓度与8%底物浓度比，前者水解度明显高于后者，而自由基清除率差别不大，故选择10%为最佳底物浓度(见图1d)。综上，胃蛋白酶水解最佳条件为：pH1.6，酶浓度3000U·g-1，底物浓度10%，水解时间3h。

3.2胰蛋白酶水解条件优选

采用不同条件胰蛋白酶水解人参蛋白，并测定水解度和自由基清除率，结果见图2a、2b、2c、2d。

图2 胰蛋白酶不同水解条件下人参蛋白的水解度和自由基清除率测定

图2结果表明，人参蛋白在不同pH条件下，经胰蛋白酶水解后，水解度与自由基清除率不同。其中，pH8.5时水解度及自由基清除率均最高，因此选择pH8.5为最适pH(见图2a)。在pH8.5条件下，分别采用胰蛋白酶水解不同时间，结果表明水解5h时，水解度和自由基清除率均最大，因此选择水解5h为最佳水解时间(见图2b)。采用不同浓度胰蛋白酶，分别于pH8.5条件下水解人参蛋白5h，结果表明，酶浓度1000U·g-1时水解度最大，5000U·g-1时自由基清除率最大，但由于酶与底物比5000U·g-1与1000U·g-1时自由基清除率差别不大，考虑到酶的成本，选择1000U·g-1(1000∶1)为最佳比例(见图2c)。进一步采用不同底物即GP浓度，于pH8.5、酶浓度1000U·g-1条件下，水解5h，结果表明，底物浓度为10%时，水解度和自由基清除率均最大，故选择10%为最佳底物浓度(见图2d)。综上，胰蛋白酶水解最佳条件为：pH8.5，酶浓度1000U·g-1，底物浓度10%，水解时间8h。

3.3双酶水解液制备

按上述优选酶解条件，进行胃蛋白酶-胰蛋白酶联合水解，得双酶水解液。

3.4SDS-PAGE

将实验用人参蛋白及各酶水解液分别进行电泳，结果见图3。

注：1.Marker；2.人参蛋白；3.胰岛素；4.胃蛋白水解液；5.胰蛋白酶水解液；6.双酶水解液。图3 各样品SDS-PAGE图

由图3可见，人参蛋白经胃蛋白与双酶水解后，蛋白条带主要为小分子蛋白，分子量与胰岛素相当，约5000左右；经胰蛋白酶水解后，条带比较多但浓度都很低，无明显小分子蛋白生成。

3.5氨基酸检测

人参蛋白及其胃蛋白酶、胰蛋白酶和双酶水解液分别进行HPLC氨基酸含量分析，结果见图4。

注：AA.18种基本氨基酸对照品分离谱图；GP.人参蛋白；Pepsin.人参蛋白经胃蛋白酶水解后；Trypsin.人参蛋白经胰蛋白酶水解后；Two enzymes.人参蛋白经双酶水解后；1.天冬氨酸；2.谷氨酸；3.丝氨酸；4.2,4-二硝基苯酚；5.精氨酸；6.甘氨酸；7.苏氨酸；8.脯氨酸；9.丙氨酸；10.缬氨酸；11.蛋氨酸；12.半胱氨酸；13.异亮氨酸；14.亮氨酸；15.色氨酸；16.苯丙氨酸；17.组氨酸；18.2，4-二硝基氟苯；19.赖氨酸；20.酪氨酸。图4 样品中氨基酸HPLC图

由图4可见，与氨基酸对照品(曲线AA)比较可知，人参蛋白(曲线GP)含有17种以上氨基酸，仅15号峰色氨酸未检测到；人参蛋白经胃蛋白酶水解后(曲线Pepsin)，各氨基酸基本都能检测到，但含量均比较低，以1、6、8、19号峰，即天冬氨酸、甘氨酸、脯氨酸和赖氨酸含量较高；人参蛋白经胰蛋白酶水解后(曲线Trypsin)，各氨基酸也基本都能检测到，其中1、2、6、7、8、14、19、20号峰即天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、苏氨酸、脯氨酸、亮氨酸、赖氨酸和酪氨酸含量相对较高；人参蛋白经双酶水解后(曲线Twoenzymes)氨基酸组成与胃蛋白酶和胰蛋白酶相似，除1、2、6、8、14号峰含量相对较高外，9号峰和17号峰即丙氨酸和组氨酸含量也比较高。

4 讨论

本实验采用单因素试验优选确定人参蛋白(GP)酶解方法，通过甲醛滴定法测定水解度，结果表明，胃蛋白、胰蛋白酶及双酶水解液水解度均在10%左右。SDS-PAGE检测结果表明，GP经胃蛋白酶和双酶水解后，均生成低分子量蛋白，分子量5000左右，与胰岛素相近，但双酶水解液明显较胃蛋白酶水解液蛋白浓度低，提示胰蛋白酶的加入使部分低分子量蛋白进一步水解成了氨基酸；GP经胰蛋白酶水解后有大量蛋白条带生成，但浓度均比较低，可能是该条件下蛋白发生了一定的降解，同时与其水解不彻底有关。HPLC氨基酸检测结果表明，人参蛋白经胃蛋白酶、胰蛋白酶及双酶水解后，虽然所含的17种氨基酸基本都能检测到，但浓度均非常低，仅天冬氨酸、甘氨酸、脯氨酸、赖氨酸、谷氨酸、苏氨酸、亮氨酸、酪氨酸、丙氨酸和组氨酸浓度稍高，但也远不及人参蛋白彻底酸水解所得氨基酸含量高。

综合比较人参蛋白与各酶解液的SDS-PAGE及氨基酸分离谱图，可推测人参蛋白经胃蛋白酶、胰蛋白酶及双酶联合水解后，大部分转化成了低分子蛋白或多肽，少部分进一步水解成了氨基酸。由于食物中的蛋白质主要经胃液中的胃蛋白酶(在胃酸参与下)进行初步分解，再进入小肠经胰液、胆汁、小肠液和肠机械性消化而被吸收。所以，本实验研究结果提示，人参蛋白在体内可能以多肽和(或)氨基酸的形式被吸收。

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EnzymolysisofGinsengTotalProteinsandDeterminationofAminoAcidContent

LIHongyan1，ZHANGJianghua2，ZHANGHui3，TAOZhenyu1，YANGJingxian1，KANGTingguo1*

(1.LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine，Dalian116600，China；2.DalianPolytechnicUniversity，Dalian116034，China；3.AffiliatedHospitalofChangchunUniversityofChineseMedicine，Changchun130021，China)

Objective：The final active substances of ginseng proteins functioning in vivo were explored by comparing the component changes in ginseng proteins before and after enzymolysis.Methods：The ginseng proteins were hydrolyzed by pepsin，trypsin and double enzymes (pepsin and trypsin)，the protein and peptide content was detected by SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE)，and the amino acid composition was analyzed by HPLC.Results：The results of SDS-PAGE showed that ginseng proteins were hydrolyzed into high concentration and low molecular weight (around5000) proteins by pepsin，lower concentration proteins by trypsin，and proteins by double enzymes similar to those of pepsin hydrolysis.The results of HPLC showed that the amino acids in ginseng proteins decreased significantly after pepsin，trypsin and double enzymes hydrolysis.Conclusion：Ginseng proteins were converted into low molecular weight proteins and a small amount of amino acids after enzymolysis.

Ginseng protein，pepsin，trypsin，amino acid

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.1.008

2015-05-07)

中国博士后科学基金项目(2013M530945)

*

康廷国，教授，博士生导师，研究方向：中药鉴定学；E-mail:kangtg@126.com