张永根，王一臻，李　洋，张幸怡，林　聪，张广宁

（东北农业大学动物科学技术学院，哈尔滨　150030）

地顶孢霉培养物对奶牛瘤胃发酵、微生物区系及血液生化指标影响

张永根，王一臻，李洋，张幸怡，林聪，张广宁

（东北农业大学动物科学技术学院，哈尔滨150030）

选择四头体重600 kg装有永久性瘤胃瘘管荷斯坦奶牛，试验分为4组，分别为基础日粮组及基础日粮+10、20和30 g地顶孢霉培养物组（干物质基础）。采用4×4拉丁方试验设计，共4期，每期15 d。日粮中添加地顶孢霉培养物可降低瘤胃液pH，提高瘤胃中NH3-N、TVFA、乙酸和丙酸浓度并调节瘤胃部分微生物相对菌群数量，同时增加血液中血糖和球蛋白浓度，降低β-羟丁酸、非酯化脂肪酸和谷丙转氨酶浓度。地顶孢霉培养物可改善瘤胃发酵环境，维持瘤胃代谢稳定，对奶牛机体无不良影响。结果表明，30 g·头-1·d-1为最适添加量。

地顶孢霉培养物；奶牛；瘤胃发酵；微生物区系；血液生化参数

网络出版时间2016-8-24 15:04:00[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20160824.1504.018.html

张永根,王一臻,李洋,等.地顶孢霉培养物对奶牛瘤胃发酵和微生物区系及血液生化指标影响[J].东北农业大学学报,2016,47 (8):60-66.

Zhang Yonggen,Wang Yizhen,Li Yang,et al.Effect ofAcremonium terricolaculture on ruminal fermentation,microflora and blood biochemical parameters in dairy cows[J].Journal of Northeast Agricultural University,2016,47(8):60-66.(in Chinese with English abstract)

补充外源添加剂可调控瘤胃微生物区系生长，改善瘤胃发酵功能[1]。抗生素类添加剂应用受限，非抗生素饲料添加剂开发受关注[2]。因此，找到一种改善瘤胃发酵功能、调控瘤胃微生物作用的新型非抗生素饲料添加剂具有重要意义。

古尼虫草是寄生于土中的蝙蝠蛾科昆虫幼虫复合体[3]。其药理成分与冬虫夏草相似，包括虫草多糖、蛋白质和氨基酸、D-甘露醇、虫草素、生物碱、抗菌活性物质、免疫抑制剂等[4]。但价格昂贵限制其在动物生产中应用。地顶孢霉培养物是由古尼虫草提取的地顶孢霉菌SDAY培养基斜面培养后，经察氏培养基液体扩大培养和固体发酵室培养得到灭活的真菌饲料添加剂，由于功能性成分相似，可作为天然古尼虫草替代物质。魏建忠等研究表明，地顶孢霉培养物能加快仔猪生长速率并提高仔猪免疫能力[5]。虫草素能促进机体产生特异性抗体，加强体液免疫应答，具有很强免疫调节功能[6]。地顶孢霉培养物能提高蛋鸭体重、产蛋率、改善鸭蛋品质，显著增加蛋壳厚度[7-8]。Joonmo等指出，虫草菌丝体（与地顶孢霉培养物成分相似）可改善奶牛瘤胃微生物发酵功能，提高产气量和瘤胃中挥发性脂肪酸（VFA）浓度，促进纤维素滤纸消化[9]，增加瘤胃微生物纤维分解菌和纤维素酶活性[10]。国内研究多针对地顶孢霉培养物对仔猪及蛋鸭影响，反刍动物方面，特别是有关地顶孢霉培养物对瘤胃发酵和微生物区系影响研究相对较少。本试验旨在研究地顶孢霉培养物对奶牛瘤胃发酵、瘤胃微生物区系和血液生化指标影响，确定地顶孢霉培养物调控效果与适宜剂量，为地顶孢霉培养物在奶牛业应用提供理论依据。

1　材料与方法

1.1试验动物和日粮组成

地顶孢霉培养物（Acremonium terricola culture，ATC）购自合肥迈可罗生物工程有限公司，是由古尼虫草中提取地顶孢霉菌经人工发酵得到灭活的真菌类添加剂，含有26.84%粗蛋白（CP），5.00%粗纤维（CF），3.06%粗脂肪（EE），4.04%粗灰分（Ash）和61.06%无氮浸出物（NFE），干物质基础。其中功能性成分含量为：虫草酸84.50 g·kg-1，虫草多糖44.60 g·kg-1，虫草素0.432 g·kg-1，甾醇0.597 g·kg-1，总氨基酸218.1 g·kg-1。

试验选用4头装有永久性瘤胃瘘管的健康荷斯坦奶牛，体重均在600 kg，拴饲。预试期与正式期日粮一致，玉米青贮，羊草及苜蓿作粗饲料。先粗后精，于每日早晚6:00准确饲喂日粮，全天自由饮水，基础饲粮组成及营养水平见表1。

表1　基础饲粮组成及营养水平Table 1　Ingredient and chemical composition of the diet

1.2试验设计

试验采用4×4拉丁方试验设计，分为A组、B组、C组和D组。A组：基础日粮；B组：基础日粮+10 g地顶孢霉培养物（干物质基础）/天；C组：基础日粮+20 g地顶孢霉培养物/天；D组：基础日粮+30 g地顶孢霉培养物/天。预饲期晨饲前，将地顶孢霉培养物与100 g基础日粮混合，预饲奶牛，完全采食后继续饲喂其他基础日粮[11]，试验分4期，每期预饲期15 d，正式期3 d。

1.3样品采集和指标测定

1.3.1样品采集与保存

分别于正式期3 d内，晨饲后0、2、4、6、8、10和12 h对试验牛取瘤胃液50 mL，4层纱布过滤并当场测定瘤胃液pH，离心后采集上清液存放于10 mL离心管，加入25%偏磷酸1 mL固氮，于-20℃冰箱保存，待测瘤胃液VFA和NH3-N浓度。

于正式期3 d内，对所有牛颈静脉采血10 mL，1次性真空采血管（规格：无添加剂管）收集，离心制得血浆，5 mL离心管收集，-20℃冷冻保存，待测血液生化指标。

1.3.2瘤胃液pH测定

采样后立即测定pH，仪器采用Sartorius Basic pH Meter PB-20型酸度计。

1.3.3瘤胃液NH3-N测定

瘤胃液NH3-N采用冯宗慈等比色法测定[12]。

1.3.4瘤胃液VFA浓度测定

气相色谱仪(岛津GC-2010，日本)测定瘤胃液中TVFA、乙酸、丙酸和丁酸含量[13]。

1.3.5血液生化指标测定

采用意大利Fully全自动生化分析仪测定血清生化指标：谷丙转氨酶（ALT），谷草转氨酶（AST），甘油三酯（TG），胆固醇（CHOL），高密度脂蛋白（HDL），低密度脂蛋白（LDL），血清尿素氮（BUN）和血糖（GLU），总蛋白（TP），白蛋白（ALB），球蛋白（GLB），碱性磷酸酶（ALP），β-羟丁酸（BH⁃BA），非酯化脂肪酸（NEFA）。试剂盒均购自北京中生北控生物科技股份有限公司，具体方法参见试剂盒说明书。

1.3.6瘤胃原虫数量和菌群测定

于正式期最后2 d，晨饲后0、2、4、6、8、10和12 h采集瘤胃液，检测瘤胃细菌数量。采用珠磨-十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法提取瘤胃液总DNA[14]。风干后DNA溶于TE缓冲液，于-20℃待测。紫外可见分光光度计测定所提取总DNA浓度和纯度，确保OD260与OD280比值在1.6～1.8。通过荧光定量PCR方法检测瘤胃液总菌，普雷沃氏菌（Prevotella），黄色瘤胃球菌（Ruminococcus flavefa⁃ciens），白色瘤胃球菌（Ruminococcus albus），产琥珀酸丝状杆菌（Fibrobacter succinogenes），牛链球菌（Streptococcus bovis），溶纤维丁酸弧菌（Butyrivibrio fibrisolvens）和原虫（Protozoal population）相对含量，引物参考文献[15]，全序列引物见表2。荧光定量所用仪器为ABI 7500型荧光定量PCR仪，Realtime PCR SYBR Green I RT-PCR试剂盒购自大连宝生物公司。Real-time PCR扩增反应参数包括95℃变性7 min，55℃1 min，72℃3 min，35个循环；72℃延伸7 min。

根据测得阈值循环（Ct），计算目标菌的相对菌群数量（Relative population size，RPS）[16]。

表2　荧光定量PCR引物Table 2　Primers used for RT-PCR detection of microbial species

1.4数据统计分析

按照4×4拉丁方试验设计，采用SAS 9.1.2软件包中PROC MIXED程序作数据分析。

模型如下：

其中，Yijk为因变量值，μ为总体平均值，Ti为处理（i=1-3），Pj为试验期（j=1-3），Ck为试验牛（k=1-3），Eijk为残差值。

P<0.05代表差异显著，结果用平均值和标准误表示。

2　结果与分析

2.1地顶孢霉培养物对奶牛瘤胃发酵影响

地顶孢霉培养物对奶牛瘤胃发酵影响见表3，与A组相比，B、C、D组极显著提高瘤胃中NH3-N浓度，C组和D组提高瘤胃液中总挥发酸（TVFA）和乙酸浓度且差异极显著（P<0.01），其中D组极显著提高瘤胃液中丙酸浓度（P<0.01）并显著降低瘤胃pH（P< 0.05）。丁酸浓度各组间无显著差异（P>0.05）。

2.2地顶孢霉培养物对奶牛瘤胃菌群影响

由表4可知，与A组相比，D组可显著提高瘤胃中原虫相对菌群数量（P<0.05），其他各组差异不显著（P>0.05）。试验组黄色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌和溶纤维丁酸弧菌相对菌群数量极显著高于A组（P<0.01），其中D组黄色瘤胃球菌相对数量极显著高于B组（P<0.01），白色瘤胃球菌和溶纤维丁酸弧菌各试验组间差异不显著（P>0.05）。C组和D组普雷沃氏菌和牛链球菌相对数量极显著高于A组（P<0.01）。但与A组相比，试验组产琥珀酸丝状杆菌相对数量极显著降低（P<0.01）。

2.3地顶孢霉培养物对奶牛血液生化指标影响

由表5可知，地顶孢霉培养物可极显著提高奶牛血液中血糖浓度（P<0.01）。B组、C组和D组血糖浓度极显著高于A组（P<0.01），其中C组和D组血液中球蛋白浓度极显著高于A组（P<0.01），但B组和A组相比无显著差异。C组和D组显著降低血液中β-羟丁酸浓度（P<0.05），其中D组显著降低血液中非酯化脂肪酸和谷丙转氨酶浓度（P<0.05）。此外，添加地顶孢霉培养物可提高血液中碱性磷酸酶浓度，但各组间差异不显著（P>0.05）。

综合以上分析可知，地顶孢霉培养物最佳添加量为30 g·头-1·d-1。

表3　地顶孢霉培养物对奶牛瘤胃发酵影响Table 3　Effects of Acrermonium terricola culture on ruminal fermentation in dairy cows

表4　地顶孢霉培养物对瘤胃微生物影响Table 4　Effects of Acremonium terricola culture on ruminal microflora

表5　地顶孢霉培养物对奶牛血液生化指标影响Table 5　Effects of Acrermonium terricola culture on the blood biochemical parameters of dairy cows

3　讨论与结论

3.1地顶孢霉培养物对瘤胃发酵影响

评价瘤胃发酵效率一般采用瘤胃pH、VFA和NH3-N浓度及瘤胃菌群数量等指标[17]。瘤胃微生物结构与数量是决定瘤胃发酵功能重要因素，瘤胃微生物对日粮蛋白质降解与自身合成速度直接影响NH3-N浓度[18]。研究表明，瘤胃微生物活性较强时产生相对较多VFA[17]。挥发酸产量则直接决定pH。

pH是评价瘤胃发酵状况综合性指标，主要受唾液、日粮组成、瘤胃中挥发性脂肪酸和可消化碳水化合物等因素影响。本试验中，乙酸浓度、黄色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌与原虫相对菌群数量均显著升高，最大剂量组pH降低可能由于地顶孢霉培养物促进原虫和部分纤维分解菌增殖，提高日粮中纤维降解产生大量挥发酸所致。Krause等指出，瘤胃中VFA浓度增加也可导致瘤胃pH下降[19-20]。Yeo等研究表明，具有与地顶孢霉培养物相同功能性成分的蛹虫草菌丝能增加瘤胃体外产气量和挥发酸产量，降低瘤胃pH[10]，与本试验结果一致。

NH3-N是瘤胃微生物生长繁殖所需主要氮源之一，浓度反映瘤胃细菌微生物对NH3-N利用速度和日粮中氮降解速度平衡关系[21]。本试验中，试验组普雷沃氏菌和原虫数量高于对照组，NH3-N浓度提高由于地顶孢霉培养物促进普雷沃氏菌和原虫增殖。研究表明，普雷沃氏菌在蛋白降解菌中数量最多[22]。原虫也参与蛋白降解过程[23]。因此，地顶孢霉培养物调节部分瘤胃微生物菌群数量改善日粮中蛋白质降解程度。另一方面，地顶孢霉培养物含有丰富蛋白质、氨基酸等重要功能性成分[6]，日粮中添加地顶孢霉培养物可提高瘤胃中微生物可利用蛋白浓度，使更多蛋白质转化为NH3-N，提高瘤胃内NH3-N浓度。

瘤胃发酵是反刍动物独特的营养生理功能，VFA可直接评价瘤胃发酵功能[17]。瘤胃内VFA产生菌代谢能力增强或数量增加可提高瘤胃VFA浓度，增加碳水化合物降解速率[22]，改善瘤胃内环境。因此，本试验中，瘤胃TVFA、乙酸和丙酸浓度提高可能与地顶孢霉培养物对原虫和部分纤维分解菌和非纤维分解菌相对数量增殖作用有关。黄色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌、普雷沃氏菌和原虫在改善瘤胃发酵功能方面发挥重要作用，以上菌种相对数量显著提高改善瘤胃发酵功能，提高饲料营养物质瘤胃降解速率[22]，产生大量乙酸、丙酸。Yeo等通过体外发酵试验发现蛹虫草菌丝能显著提高体外产气量和挥发酸产量[10]，这与本试验结果一致。

3.2地顶孢霉培养物对奶牛瘤胃菌群影响

瘤胃内微生物主要包括原虫和瘤胃细菌、真菌等。对反刍动物而言，瘤胃微生物数量和结构与粗饲料消化利用关系密切。本试验结果表明，日粮中添加地顶孢霉培养物提高部分纤维分解菌和非纤维分解菌数量，但产琥珀酸丝状杆菌数量却有所降低。Ahn等指出，虫草素和虫草菌丝与某些次级代谢产物具有抑制产琥珀酸丝状杆菌生长作用[24-25]，证明地顶孢霉培养物可调节瘤胃菌群结构，改善瘤胃内环境。Yeo等通过体外发酵试验证明蛹虫草菌丝能增加瘤胃内总微生物数量，提高纤维分解菌数量和纤维酶活性[10]。虫草类物质及功能性成分具有增加益生菌数量潜力[26]。通过上述分析，可推断日粮中添加地顶孢霉培养物能提高奶牛瘤胃中部分纤维分解菌和非纤维分解菌数量，促进日粮中营养物质分解，提高日粮在瘤胃中发酵潜力，但作用机制尚待进一步研究。

3.3地顶孢霉培养物对奶牛血液生化指标影响

GLU和NEFA、BHBA是衡量反刍动物能量状态重要指标。研究表明，血液中高浓度NEFA和BHBA属于酮病病理学特征[27-28]。血液中NEFA和BHBA浓度升高是能量负平衡主要特征，同时血糖浓度降低，使奶牛免疫力下降，影响奶牛生产性能。李国鹏指出，低GLU会导致血液中NEFA和BHBA升高[29]。迟景波发现，奶牛血液中GLU浓度与NE⁃FA和BHBA浓度呈负相关[30]。本试验结果表明，地顶孢霉培养物可显著降低血液中NEFA和BHBA浓度，可能是由于地顶孢霉培养物可改善奶牛机体能量负平衡状态。因此推测GLU升高是NEFA和BHBA浓度降低关键。NEFA为TG分解产物，虫草多糖能保持TG较低水平，并预防肝脏疾病和心血管疾病[31]。本试验中，B、C、D 3组TG含量降低，也可能由于地顶孢霉培养物对TG低水平维持作用导致其分解产物NEFA浓度相对降低。

正常情况下，血液中ALT和AST含量较低。血液中ALT和AST含量升高一般缘于贮藏于肝脏中ALT和AST释放作用[32]。地顶孢霉培养物中虫草多糖等功能性成分是D组血浆中ALT浓度显著降低主要原因。余伯成等发现，虫草多糖能抑制ALT和AST释放，显著降低ALT和AST活力水平，使肝细胞存活率上升[31]，与本试验结果相似。

动物机体肝脏合成是血清中蛋白主要来源，肝脏受损可能导致血清中蛋白含量降低，注射免疫抑制剂(环磷酰胺)会致使小鼠总蛋白、球蛋白、白蛋白降低[33]。本试验结果显示，地顶孢霉培养物可提高奶牛血浆中球蛋白含量。余伯成等指出，蛹虫草多糖能显著降低环磷酰胺对小鼠免疫抑制作用，提高环磷酰胺所致免疫损伤小鼠血清蛋白含量，保护肝脏[31]，与本试验结果相似。

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EffectofAcremoniumterricolacultureonruminalfermentation, microflora and blood biochemical parameters in dairy cows/ZHANG

Yonggen,WANG Yizhen,LI Yang,ZHANG Xingyi,LIN Cong,ZHANG Guangning(School of Animal Science and Technology,NortheastAgricultural University,Harbin 150030,China)

Four ruminally cannulated multiparous Holstein cows averaging 600 kg of body weight were used in a 4×4 latin square design.Trials were basal diet group and basal diet+10,20 and 30 g ACT (dry matter basis),each lasting 15 d,a total of four supplementation of ATC could reduce the rumen pH, improve concentration of NH3-N,TVFA,acetate and propionate,and regulate relative population size of ruminal microorganism.Supplementation of ATC could improve the concentration of blood glucose and globulin,and reduce the concentration of beta hydroxybutyric acid,non-esterified fatty acid and alanine aminotransferase.The ATC could improve rumen fermentation and maintain stabilization of rumen metabolism,without adverse effects to dairy cow.In the present study,the optimal dose was 30 g·cow-1·d-1.

Acremonium terricolaculture;dairy cow;ruminal fermentation;microflora;blood biochemical parameters

S816

A

1005-9369（2016）08-0060-07

2016-06-07

国家奶牛产业技术体系项目（CARS-37）

张永根（1962-），男，教授，博士，博士生导师，研究方向为反刍动物生产。E-mail:zhangyonggen@sina.com