李建立， 崔红赏， 郭洪霞， 于　洋， 吴红海， 侯艳宁



氯胺酮诱导发育期大鼠神经细胞凋亡时神经甾体17β雌二醇水平的变化

李建立1， 崔红赏2， 郭洪霞1， 于洋3， 吴红海3， 侯艳宁3

目的探讨连续大剂量应用氯胺酮引起发育期大鼠大脑皮层区神经细胞凋亡时神经甾体17β雌二醇水平的变化及机制。方法30只7日龄雄性SD大鼠，随机分为对照组和氯胺酮组，每组15只。对照组连续3 d腹腔注射等容量生理盐水，氯胺酮组连续3 d腹腔注射75 mg/kg氯胺酮，末次注药后24 h，每组取5只大鼠用免疫组织化学法检测大脑皮层区cleaved-caspase-3和CYP19A1的表达，其余幼鼠应用高效液相色谱-质谱联用法(HPLC-MS/MS)测定大脑皮层区神经甾体17β雌二醇的含量。结果与对照组比较，氯胺酮组大鼠大脑皮层区cleaved-caspase-3阳性细胞显著性增加(P<0.01)，17β雌二醇水平及CYP19A1酶的表达均显著性下降(P<0.01)。结论连续大剂量应用氯胺酮可引起发育期大鼠大脑皮层区神经细胞凋亡伴随神经甾体17β雌二醇水平下降，其机制可能与限速酶CYP19A1表达下降有关。

氯胺酮； 雌二醇； 细胞凋亡； 色谱法，高压液相； 质谱分析法； 基因

氯胺酮作为一种N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate, NMDA)受体拮抗剂，广泛应用于婴幼儿手术的麻醉。最近动物实验研究表明，在中枢神经系统的快速发育期反复使用氯胺酮可引起发育期动物大脑广泛脑区神经细胞凋亡的增加[1-3]。17β雌二醇作为一类神经甾体，对发育期大脑的发育和成熟起着十分重要的作用。研究表明，氯胺酮可引起斑马鱼发育期17β雌二醇水平的下调，导致斑马鱼发育期神经损伤[4-5]。本研究旨在探讨氯胺酮引起发育期大鼠大脑皮层区神经细胞凋亡时是否伴随神经甾体17β雌二醇水平的变化，从神经甾体的角度进一步探讨氯胺酮发育期神经毒性的发生机制。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1动物与分组母鼠与7日龄雄性幼鼠均为SD大鼠，由河北医科大学动物实验中心提供(母鼠及幼鼠动物合格证编号分别为1308067，1306107)。30只幼鼠随机分为对照组和氯胺酮组，每组15只，对照组连续3 d腹腔注射等容量生理盐水，氯胺酮组连续3 d腹腔注射75 mg/kg氯胺酮。麻醉后把幼鼠放在暖箱中,给予低流量氧气(2 L/min)，密切观察幼鼠的呼吸频率以及皮肤颜色。各组幼鼠与母鼠的分离时间均为250 min[3]。

1.1.2试剂氯胺酮(福建古田药业有限公司提供，批号H35020148)，甲睾酮(MT)(中国药品生物检定所)，丹酰氯(Sigma-Aldrich公司)，乙酰乙酯、正己烷、甲酸(天津康科德科技有限公司)，cleaved-caspase-3试剂(美国Cell Signaling公司)，CYP19A1试剂(Abcam公司)。

1.1.3主要仪器液质联用仪(1100LC/MSD，美国Agilent公司)，固相萃取装置(Visiprep DL，美国Supelco公司)，固相萃取柱(Oasis HLB SPE，美国Waters公司，规格：30 mg/mL，30 μm)，氮气吹干仪(北京八方世纪公司)。

1.2方法

1.2.1免疫组织化学染色法检测大鼠大脑皮层区cleaved-caspase-3和CYP19A1的表达末次给药后24 h，每组取5只幼鼠给予巴比妥麻醉，断头取皮层组织。4%多聚甲醛固定皮层脑组织48 h，用梯度乙醇脱水，石蜡包埋，5 μm厚度切片。切片经二甲苯浸泡3次，梯度乙醇脱水(每次5 min)，自来水浸泡5 min。抗原修复20 min，自然冷却。滴加3% H2O2去离子水，室温孵育10 min，PBS冲洗3次，每次5 min。滴加正常山羊血清工作液，室温孵育15 min，进行封闭。去除血清，滴加兔抗cleaved-caspase-3(1∶50)和CYP19A1(1∶100)，4 ℃过夜，PBS冲洗3次,每次5 min。滴加生物素化二抗工作液，室温孵育15 min，PBS冲洗3次,每次5 min。滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，室温孵育15 min，PBS冲洗3次,每次5 min。滴加DAB试剂显色，显微镜下控制显色时间，自来水冲洗终止反应，常规脱水，中性树胶封片。

1.2.2神经甾体提取末次给药后24 h，每组取10只幼鼠给予巴比妥麻醉，断头取皮层组织。每100 mg脑组织加入1 mL PBS液匀浆，通过液液萃取的方法提取神经甾体。加入20 μL内标MT(30 ng/mL)，然后加入2 mL乙酸乙酯/正己烷(9∶1)，涡旋混匀5 min，12 000 r/min离心5 min，转移上层有机相至7 mL玻璃试管中，重复萃取3次，合并有机相，50 ℃水浴N2吹干。然后依次加入10 μL Na2CO3、10 μL丹酰氯(5 mg/mL)、乙腈80 μL，超声1 min，涡旋1 min，瞬时离心，60 ℃水浴中衍生40 min，衍生反应结束后，12 000 r/min离心10 min，取上清，4 ℃保存待测神经甾体。

1.2.3神经甾体含量测定(1)色谱条件：分析柱为Agilent XDB C18(4.6 mm×50 mm,1.8 μm)；保护柱为Agilent XDB C18(4.6 mm×12 mm)；流动相为A水(含0.1%甲醇)，B甲醇(含0.1%甲醇)，柱温40 ℃，流速0.5 mL/min；洗剂梯度为0～6.5 min，36%A；6.5～6.6 min，30%A；6.6～17 min，10%A；17～18 min，36%A。进样量30 μL，每针运行18 min。(2)质谱条件：离子化方式为大气压化学离子源；喷雾电压4 500 V；鞘气(N2)压力30 L/min；辅助气压力5 L/min；离子传输管温度270 ℃。离子检测方式：正离子多反应监测，用于定量分析的离子反应分别为(m/z)254.97→(m/z)132.9，158.9(17β雌二醇),(m/z)303.1→(m/z)97.04，109.06(MT)。

2　结　果

2.1氯胺酮对发育期大鼠大脑皮层区cleaved-caspase-3表达的影响与对照组比较，氯胺酮组大鼠大脑皮层区cleaved-caspase-3阳性细胞数/0.01 mm2显著增加(P<0.01，图1～2)。

2.2神经甾体的测定17β雌二醇和内标MT的保存时间分别为7.1，6.5 min。标准曲线如下，线性范围1～200 ng/g，在此范围内待测物线性关系良好。待测物回收率为(98.8±5)%，日间和日内变异均<12.6%和<9.5%，准确度(相对误差)<15%。色谱图见图3。

Y=0.036 938 9+0.141 111 4×X

R2=0.993 7

W=1/X2

2.3氯胺酮对发育期大鼠皮层区17β雌二醇水平及CYP19A1表达的影响与对照组比较，氯胺酮组大鼠大脑皮层区神经甾体17β雌二醇水平及CYP19A1表达显著下降(P<0.01，图4～6)。

3　讨　论

氯胺酮作为NMDA受体拮抗药，动物实验研究表明，在中枢神经系统快速发育期反复应用氯胺酮可导致大脑神经细胞凋亡，并可能引起动物成年后的学习记忆功能损伤[1-3]。众多学者对氯胺酮引起发育期大脑神经损伤的机制进行了大量的研究，但其确切机制目前尚不十分清楚[1-3]。以往研究表明，氯胺酮诱导神经元凋亡与引起神经递质NMDA的受体亚单位NR1的上调有关[6]。神经甾体作为第4代神经递质，具有催眠镇静、抗焦虑、抗惊厥、改善学习记忆功能及神经保护作用。研究表明，在大脑发育和成熟过程，神经甾体水平的下降甚至缺乏会导致神经发育和行为学方面的异常[7]。有研究发现，大脑神经甾体含量变化与帕金森病、阿尔茨海默病、多发性硬化症、创伤性颅脑损伤等在内的各类疾病有关[8-11]。本研究着重探讨氯胺酮引起发育期大鼠大脑神经损伤是否与神经甾体如17β雌二醇的水平变化有关。

雌二醇作为一种内源性神经甾体，在神经元发育过程中发挥着重要的调节作用，促进神经元的存活以及功能维护。张吉强等研究发现，出生后大鼠大脑可表达雌激素合成酶即芳香化酶和雌激素β受体，提示雌激素可能通过其受体对早期神经发育产生调节作用[12]。17β雌二醇可抑制大脑皮层成神经细胞DNA断裂，抑制神经细胞凋亡，同时诱导成神经细胞的增生和分化，还具有促进神经细胞轴突及树突的生长，建立和维持突触功能的作用[13]。有研究表明，抑制胶质细胞胆固醇合成雌二醇的过程，可导致尼曼匹克症C型的神经退化性改变，而使用17β雌二醇可减轻神经损伤[14]。另有研究表明，NMDA受体拮抗剂MK-801诱导的神经毒性与神经甾体17β雌二醇水平下降有关[15]。以上研究均表明，17β雌二醇对发育期大脑的发育及成熟发挥着重要的调节作用。本研究结果还表明，氯胺酮引起皮层区神经甾体17β雌二醇水平下降，这说明连续大剂量应用氯胺酮引起发育期大鼠皮层区神经细胞凋亡可能与神经甾体17β雌二醇水平下降有关。

在神经甾体的合成通路中，睾酮是雌二醇合成的上游产物，通过CYP19A1酶合成雌二醇[16]。有研究认为，氯胺酮通过抑制CYP19A1酶的基因表达,抑制发育期斑马鱼睾酮向雌二醇的合成，导致神经甾体17β雌二醇水平的明显下降[4]。在中枢神经系统，通过激活CYP19A1酶的表达可促进17β雌二醇的合成，进而发挥神经保护作用[13]。研究证实，大脑合成神经甾体所需的各类酶主要位于神经元和胶质细胞的线粒体内[17-18]。研究表明，氯胺酮引起发育期大脑损伤与激活线粒体凋亡通路有关[19]。因此推测，氯胺酮可能通过抑制神经甾体17β雌二醇合成限速酶CYP19A1的活性，引起17β雌二醇的合成代谢下降，抑制17β雌二醇对神经元的调节作用，引起神经元功能障碍，最终导致神经元凋亡。

总之，连续大剂量应用氯胺酮可引起发育期大鼠皮层区神经细胞凋亡，凋亡发生可能与氯胺酮抑制皮层区CYP19A1酶的表达导致神经甾体17β雌二醇水平的下降有关。本研究从神经甾体的角度探讨了氯胺酮诱导发育期大脑神经损伤的机制，下一步应研究外源性给予17β雌二醇恢复神经甾体17β雌二醇水平是否对氯胺酮引起的发育期大鼠皮层区神经细胞凋亡产生保护作用。

[1]Duan X, Li Y, Zhou C,etal. Dexmedetomidine provides neuroprotection:impact on ketamine-induced neuroapoptosis in the developing rat brain[J].ActaAnaesthesiolScand, 2014,58(9):1121-1126.

[2]Liu J R, Baek C, Han X H,etal. Role of glycogen synthase kinase-3β in ketamine-induced developmental neuroapoptosis in rats[J].BrJAnaesth, 2013,110(Suppl 1):i3-9.

[3]Huang L, Liu Y, Jin W,etal. Ketamine potentiates hippocampal neurodegeneration and persistent learning and memory impairment through the PKCgamma-ERK signaling pathway in the developing brain[J].BrainRes, 2012,1476:164-171.

[4]Trickler W J, Guo X, Cuevas E,etal. Ketamine attenuates cytochrome p450 aromatase gene expression and estradiol-17β levels in zebrafish early life stages[J].JApplToxicol, 2014,34(5):480-488.

[5]Kanungo J, Cuevas, Ali S F,etal. Ketamine induces motor neuron toxicity and alters neurogenic and proneural gene expression in zebrafish[J].ApplToxicol, 2013,33(6):410-417.

[6]Wang C，Sadovova N，Fu X，etal． The role of the N-methyl-D-aspartate receptor in ketamine-induced apoptosis in rat forebrain culture[J].Neuroscience, 2005,132(4):967-977.

[7]Kawato S, Yamada M, Kimoto T. Brain neurosteroids are 4thgeneration neuromessengers in the brain:cell biophysical analysis of steroid signal transduction[J].AdvBiophy, 2001,37(1):1-48.

[8]于洋, 薛改, 吴红海, 等. Aβ25-35对大鼠大脑皮层皮质神经元神经甾体水平的影响[J]. 中国药理学通报, 2010,26(6):783-786.

[9]Luchetti S, Huitinga I, Swaab D F. Neurosteroid and GABA-A receptor alterations in Alzheimer’s disease, Parkinson’s disease and multiple sclerosis[J].Neuroscience, 2011,191:6-21.

[10]Lapchak P A. The neuroactive steroid 3-alpha-ol-5-beta-pregnan-20-one hemisuccinate, a selective NMDA receptor antagonist improves behavioral performance following spinal cord ischemia[J].BrainRes, 2004,997(2):152-158.

[11]Roglio I, Bianchi R, Gotti S,etal. Neuroprotective effects of dihydroprogesterone and progesterone in an experimental model of nerve crush injury[J].Neuroscience, 2008,155(3):673-685.

[12]张吉强, 蔡文琴. 雌激素Beta受体在成年雄性大鼠脑内的免疫组化定位研究[J]. 第三军医大学学报, 2001,23(8):895-897.

[13]卫永旭, 初明， 蔺友志. 脑芳香酶的神经保护作用[J]. 中国微侵袭神经外科杂志, 2011,16(4):187-189.

[14]Chen G, Li H M, Chen Y R,etal. Decreased estradiol release from astrocytes contributes to the neurodegeneration in a mouse model of Niemann-Pick disease type C[J].Glia, 2007,55(15):1509-1518.

[15]de Olmos S, Bueno A, Bender C,etal. Sex differences and influence of gonadal hormones on MK801-induced neuronal degeneration in the granular retrosplenial cortex of the rat[J].BrainStructFunct, 2008,213(1-2):229-238.

[16]Luchetti S, Bossers K, Vande Bilt S,etal. Neurosteroid biosynthetic pathways changes in prefrontal cortex in Alzheimer’s disease[J].NeurobioAgeing, 2011,32(11):1964-1976.

[17]Mellon S H, Griffin L D, Compagnone N A. Biosynthesis and action of neurosteroids[J].BrainResRev, 2001,37(1-3):1-12.

[18]Leskiewicz M, Budziszewska B, Basta-Kaim A,etal. Effects of neurosteroids on neuronal survival.Molecular basis and clinical perspectives[J].ActaNeurobiolExp, 2006,66(4):359-367.

[19]Braun S, Gaza N, Werdehausen R,etal. Ketamine induces apoptosis via the mitochondrial pathway in human lymphocytes and neuronal cells[J].BrJAnaesth, 2010,105(3):347-354.

(编辑:何佳凤)

Changes in Level of 17β-estradiol when Ketamine Induces Neuroapoptosis in the Developing Rat Brain

LI Jianli1, CUI Hongshang2, GUO Hongxia1, YU Yang3, WU Honghai3, HOU Yanning3

1.Department of Anesthesiology, Hebei General Hospital, Shijiazhuang 050051, China；2.Department of Thoracic Surgery, Hebei General Hospital, Shijiazhuang 050051, China；3.Department of Pharmacy, Bethune International Peace Hospital of Chinese PLA, Shijiazhuang 050082, China

ObjectiveTo investigate the effect of ketamine on 17β-estradiol level in the developing rat brain.Methods30 aged 7 days SD male rats were randomly divided into two group: Group C and Group K.Group C was intraperitoneally injected with same volume of saline for three consecutive days, Group K was intraperitoneally injected with 75 mg/kg ketamine for three consecutive days. 24 hours after the last injection, five rats from each group were decapitated under deep anesthesia and the PFC portion was isolated todetect cleaved caspase-3 and CYP19A1 expressions by immunohistochemical analysis (n=5).The PFC of other rats was harvested to determine 17β-estradiol concentration by HPLC-MS/MS assay(n=10).ResultsCompared with the Group C, the expression of cleaved caspase-3 in Group K increased significantly after being treated with 75 mg/kg ketamine for three consecutive days(P<0.01), while 17β-estradiol level and CYP19A1 expression in PFC significantly reduced(P<0.01).ConclusionKetamine can cause decrease in the endogenous 17β-estradiol level, which was associated with the decrease of CYP19A1 expression.

ketamine; estradiol; apoptosis; chromatography, high pressure liquid; mass spectrometry; genes

2015-11-19

河北省卫生厅医学重点课题(ZL20140095)

1.河北省人民医院 麻醉科，石家庄050051；

2.河北省人民医院 胸外科，石家庄050051；

李建立(1976-)，男，副教授，医学博士

侯艳宁. Email:biph2011@163.com

R322.8； R347.913； R741.02； R971.2； R977.12

A

1672-4194(2016)02-0093-05

3.白求恩国际和平医院 药剂科，石家庄050082