周中兴，潘娜娜，谭丽娟（青岛大学医学院附属医院黄岛院区心内科，山东 青岛 266003）

盐酸法舒地尔对大鼠主动脉球囊损伤后血管内膜及IL-8、TGF-β1的影响

周中兴，潘娜娜，谭丽娟
（青岛大学医学院附属医院黄岛院区心内科，山东 青岛 266003）

目的 探讨盐酸法舒地对大鼠主动脉球囊损伤术后血管内膜增生的影响，并测定血清中IL-8、TGF-β1浓度及TGF-β1在血管内皮细胞和平滑肌细胞的表达情况。方法 选取SD大鼠40只，随机分为对照组8只、手术组16只、药物组16只，手术组和药物组给予左颈动脉切口，并2 F球囊导管插管行主动脉内膜损伤，手术组给予NS（0.5 ml/100 g/bid），药物组给予盐酸法舒地（0.5 mg/100 g/bid）腹腔注射，分别于损伤后14天、28天取大鼠主动脉血管标本，HE染色观察各组增殖血管内膜形态学变化，并测量新生内膜面积（IA）、中膜面积（MA）、内膜厚度（IT）、中膜厚度（MT）、内膜面积/中膜面积比值（IA/MA），观察大鼠血管内皮损伤后内膜增生情况。并用ELISA法检测血清中IL-8、TGF-β1的浓度，并免疫组化检测TGF-β1在损伤后血管新生内膜及中膜的表达情况。结果 对照组血管内膜为扁平的内皮细胞，中层为梭形平滑肌细胞的排列，内膜光滑，未见平滑肌细胞增生及增殖情况。手术组球囊损伤后14天内膜增生明显，其IA、MA、IT、MT、IA/MA显著高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），至28天内膜继续增生。药物组在14天内膜增生明显，内膜及中膜面积及厚度的测量值显著高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），与模型组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。28天后药物组内膜增厚较14天时减少，差异有统计学意义（P＜0.05），与手术组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。至14天时两损伤组IL-8、TGF-β1在血浆中检测出，而药物组14天时血浆中可检测到IL-8、TGF-β1相比手术组减少，差异有统计学意义（P＜0.05），至28天时手术组仍可检测到IL-8、TGF-β1较14天时减少。至28天药物组上述血清中的浓度较14天时减少，差异有统计学意义（P＜0.05），与手术组相比减少，差异有统计学意义（P＜0.05）。并14天时药物组TGF-β1在新生内膜及中膜可见表达，与模型组相比，差异无统计学意义（P＞0.05），而28天时表达量相比模型组减少，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 盐酸法舒地可有效抑制大鼠主动脉球囊损伤术后主动脉内膜的增生及增殖，从而减少管腔面积的丢失，可能与其抑制早期炎症因子IL-8及转化生长因子-β1的表达有关。

盐酸法舒地；球囊损伤；动脉内膜；IL-8；TGF-β1

随着经皮冠状动脉血管成形术的广泛开展，不仅降低了冠心病，特别是急性心肌梗死患者的近期死亡率，而且改善了长期预后。而术后再狭窄的发生率严重影响了其远期疗效，多数研究认为术后的炎症反应及中膜平滑肌细胞的迁移、增殖不仅参与了早期血栓事件的发生，更是参与了后期血管病理性重构和慢性缩窄的过程［1］。虽然冠状动脉支架植入术可以抑制动脉血管的弹性回缩，改善血管壁的重塑，从而使再狭窄率降低，但另一方面它却有增加血管壁损伤和血栓形成的危险，尤其是血管内皮的损伤进一步加重了炎症反应，纤维层的断裂导致血管壁中层平滑肌细胞过度增殖并向内膜迁移，血管新生内膜形成导致再狭窄。因此早期抑制炎症反应及中膜的病理性重构、重塑过程成为预防术后再狭窄的有效措施。IL-8是早期炎症反应所释放的重要因子，转化生长因子β1是一组新近发现的调节细胞生长、分化、免疫的TGF-β超家族，是多种细胞损伤后早期表型转化及增殖的始动因子。Rho激酶为Rho蛋白下游作用底物，主要发挥信息传导和分子开关作用。最早应用于蛛网膜下腔出血引起的脑血管痉挛，改善局部脑动脉循环的功能，而其在心血管领域的应用得到广泛证实，特别是在冠状动脉痉挛、心肌梗死、再狭窄、心力衰竭方面［2］。本文通过盐酸法舒地尓对于大鼠主动脉球囊损伤术后主动脉内膜增殖及对IL-8、TGF-β1表达的影响，旨在探讨法舒地尓防治血管再狭窄的可能机制。

1　材料与方法

1.1材料

健康雄性SD大鼠40只，体质量（400±50）g购自青岛市动物实验中心。盐酸法舒地尓（天津红日制药，30 mg/2 mL）；2.0 F自制球囊导管；高清彩色像分析系统（HPIA2000）（美国Beckman Coulter公司）；表达的免疫组化染色检测试剂盒（北京碧云天生物有限公司）。

1.2方法

1.2.1动物模型的建立及实验分组

40只SD大鼠分为3组：正常对照组（n=8）；手术组（主动脉球囊损伤术+腹腔注射NS 0.5 ml/100 g/Bid，n=16）；法舒地尓组（HF球囊损伤+腹腔注射盐酸法舒地尓0.5 mg/100 g/Bid，n=16）。

1.2.2大鼠主动脉内膜损伤模型的建立

将大鼠用将大鼠以3%的水合氯醛（30 mg/kg）腹腔注射麻醉，做颈部长约2 cm正中切口，钝性分离左侧颈总动脉，远心端用丝线结扎，近心端用无创动脉夹夹闭，在两端间剪一小口，从切口向近心端缓慢插入球囊导管（2 F，球囊长度2 cm），深度约10～12 cm至髂动脉分叉处，以0.15～0.2 mL生理盐水充盈球囊，回拉球囊并旋转导管至左颈总动脉分叉处，反复抽拉6次以确保充分剥脱内皮，拔出球囊导管，结扎血管，逐层缝合切口，术后3天给予青霉素20万IU/100 g腹腔注射，并常规饲养至处死，采用HE免疫组化染色，光镜观察球囊损伤大鼠颈动脉使动脉血管内膜剥脱，判断模型建立成功。

1.2.3增殖血管内膜面积测定

分别于球囊损伤后14天、28天取对照组4只及损伤组各6只大鼠腹腔注射过量的水合氯醛，左侧腹部切口5～7 cm，钝性分离并游离主动脉，肾动脉分叉处逆行分离至主动脉根部，插管用生理盐水灌洗胸腹主动脉。留取主动脉标本组织2 cm左右，用4%中性多聚甲醛溶液固定24 h的主动脉组织标本，常规按石蜡切片制作程序（固定、脱水、透明及包埋处理），然后切片脱蜡后，进行HE染色。随机选取5个视野，光镜下观察新生内膜增生情况，图像分析系统测定IA、MA、MA、IT、IA/MA。

1.2.4酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清IL-8、TGF-β1浓度

分别于术后14天、28天，制取主动脉组织前，大鼠摘除眼球取血（采集前动物禁饮食8 h），送本院检验科，ELISA法测定血浆中IL-8、TGF-β1的浓度，具体操作步骤按照ELISA检测试剂盒的说明书进行。

1.3统计学处理

以SPSS 17.0统计软件包进行统计分析。计量资料以“±s”表示，采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结 果

2.1主动脉标本组织病理学形态及定量分析

手术组及药物组（HF）在术中及术后有2只大鼠死亡，考虑与术中动脉夹层、麻醉药过量及术后长期腹腔注射，大鼠长期处于应激状态，导致进食减少引起。各组主动脉标本组织病理学见图1、图2、图3。14天后手术组及HF组大鼠主动脉内膜增生明显，其IA、MA、MA、IT、IA/MA相比于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。手术组与HF组之间，差异无统计学意义（P＞0.05）。至28天时手术组内膜继续增生，药物组IA、MA、MA、IT、IA/MA指标的改善相比14天时，差异有统计学意义（P＜0.05），与手术组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

2.2酶联免疫吸附法（ELISA）

14天后血清中IL-8、TGF-β1在手术组及HF组可检测出。IL-8在HF组血浆中少于手术组，差异有统计学意义（P＜0.05）。至28天血清中IL-8在HF组与对照组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）；TGF-β1在手术组仍持续检测出，见表2。

图1　内膜HF染色×100倍

图2　内膜HF染色×100倍

图3　内膜HF染色×400倍

表1　各组大鼠主动脉内膜增生情况定量分析（±s，mm/mm）

表1　各组大鼠主动脉内膜增生情况定量分析（±s，mm/mm）

注：*与对照组相比，P＜0.05；#与手术组相比，P＜0.05；θ与对照组相比，P＞0.05

对照组　　手术组　HF组14 d　28 d　14 d　28 d　14 d　28 d （IA）　0.96±0.12　0.99±0.10　2.41±1.21*　4.32±1.15**　2.23±0.77*#　1.25±0.46αβ（MA）　2.53±0.54　2.61±0.34　4.12±1.02*　6.18±1.42**　3.71±1.12*#　3.55±1.04αβ（MT）　1.43±0.14　1.41±0.23　1.98±1.33*　2.26±0.57**　1.76±0.57*#　1.59±0.23αβ（IT）　0.45±0.07　0.53±0.10　1.23±1.42*　1.56±0.38**　1.16±0.26*#　0.64±0.12αβ（IA/MA）　36.97±4.06　34.38±3.76　58.49±5.18*　69.90±3.13**　60.10±2.08**　35.21±3.53αβ注：与对照组相比，*P＜0.05；与对照组相比，**P＜0.01；与手术组相比，#P＞0.05；与手术组相比，αP＜0.01；与14天相比，βP＜0.05 表2 IL-8、TGF-β1在三组动物血浆中浓度的定量检测（x±s）对照组　　手术组　HF组14 d　28 d　14 d　28 d　14 d　28 d IL-8（μg/L）　63.24±8.25　58.91±11.17　135.87±22.25*　149.28±28.61*　127.33±19.32*　70.59±9.24#θ TGF-β1（ng/L）　12.03±2.63　13.84±2.95　18.48±4.67*　21.62±5.33*　17.66±5.66*　13.14±3.11#θ

3　讨 论

弥漫性的血管内皮功能障碍参与了冠心病的发生、发展的全过程［3］，特别对于急性冠脉综合症（acute coronary syndrome ACS）。PTCA及支架植入术虽可迅速改善患者的冠状动脉血供，缓解症状，但术后诱发的血管壁损伤和炎症反应［4］，将加速病变的进展。目前认为冠状动脉支架置入对动脉壁损伤导致血管内皮细胞损伤，血小板聚集，促进炎症的发生，加重了病变部位的内皮功能损害。炎性细胞和内皮细胞及血小板又可释放大量的细胞因子促使血管平滑肌增殖和迁移，影响患者远期预后［5］。本实验中球囊损伤术后14天主动脉内膜镜下面积、中膜面积、内膜厚度、中膜厚度、内膜面积/中膜面积相比对照组增加显著，从而导致管腔面积的早期丢失。至28天时镜下观察到手术组内膜面积持续丢失，病理性重塑机制导致管腔进一步狭窄，与既往研究一致。

Rho激酶是最早发现、也是目前研究较为清楚的一个小G蛋白RhoA的下游效应器。以两种同源性极高的异构体存在：ROCKI（ROCKα炎症反应过程）和ROCKII（ROCKβ血管平滑肌细胞）。ROCK的激活可在分子及细胞水平参与血管损伤后的炎症反应及内膜的增生、增殖过程。ROCK的激活可使一氧化氮合酶的表达下调，内皮细胞来源的NO在调节血管张力、抑制血小板聚集、平滑肌细胞增殖和防止白细胞向血管壁的粘附等过程中发挥重要作用。法舒地尔（fasudil，Fas）是第一个也是惟一应用于临床的Rho激酶抑制剂，主要用于治疗蛛网膜下腔出血所致的脑血管痉挛及相关的神经系统缺血症状。在许多已开展的临床前期研究中，发现法舒地尔对包括冠状动脉痉挛、高血压、肺动脉高压、冠脉再通手术后的再狭窄和AS在内的多种心血管疾病均有良好的治疗作用和较高的安全性。研究证实，IL-8在心血管介入手术后无菌性炎症反应中参与了众多细胞因子的激活及趋化，是冠脉介入术后心脏事件强有力的预测因子［6］。本研究表明大鼠主动脉球囊损伤后血清中早期炎症反应的发生，并测得早期应用法舒地尓可有效抑制早期炎症反应的程度，减轻血管内膜内皮的损伤，并进一步抑制后续炎症反应的进程，可能是其预防术后急性血栓事件及再狭窄的机制之一。

综上所述，盐酸法舒地尓（hydroxy fasudil HF）可有效抑制主动脉损伤术后管腔面积的丢失，预防术后再狭窄的发生［7］，而抑制早期炎症因子IL-8及TGF-β1的产生与表达可能是其机制之一。究其分子机制及长期用药效果还有待进一步研究，但可为冠脉介入治疗术后再狭窄的防治提供新的依据，使盐酸法舒地尓的临床应用范围更加广泛。

［1］贾 晶，毛莉娜，王 超，李红兵.转化生长因子β1与心血管疾病［J］.中国心血管病研究，2007，（27）4:1672- 530.

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［4］张 曼，佟 浩，刘铁军，等.法舒地尔对大鼠动脉粥样硬化及Rho激酶表达的影响［J］.中国现代医学杂志，2010，20（6）:805-809.

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本文编辑：孙春宇

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ISSN.2095-6681.2016.08.078.04