赵林敏,何玉宁,沈　慧,宁伟伟,陶宁萍

(上海海洋大学食品学院,上海 201306)



玛卡中生物碱和芥子油苷的提取及其在玛卡酒中的稳定性研究

赵林敏,何玉宁,沈慧,宁伟伟,陶宁萍*

(上海海洋大学食品学院,上海 201306)

以澳大利亚有机黄玛卡粉为原料,采用食用酒精提取有效成分,得到的提取液经浓缩、与白酒调制、冷沉、过滤等工序制得玛卡酒。以总生物碱和芥子油苷的提取率为评价指标,对食用酒精浓度、料液比、提取天数进行优化,并对其中生物碱、芥子油苷和玛卡酰胺的稳定性进行监测。结果表明:最佳提取工艺条件为食用酒精浓度90%、料液比10 mg/mL、提取天数6 d,提取液中生物碱、芥子油苷和玛卡酰胺提取率分别为91.10%±1.30%、92.28%±1.64%、90.50%±1.86%;最终玛卡酒产品中生物碱、芥子油苷和玛卡酰胺的保存率分别为81.20%±1.26%、68.33%±1.04%、81.76%±0.78%。对玛卡酒进行半年的贮藏性实验,发现芥子油苷含量降低最多,生物碱次之,玛卡酰胺稳定性良好。

玛卡酒,生物碱,芥子油苷,玛卡酰胺,稳定性

玛卡(Maca),学名LepidiummeyeniiWalp.,原产秘鲁安第斯山脉[1]。我国从2002年引种玛卡,主要分布在云南和新疆,2011年5月,卫生部正式批准玛卡作为新资源食品[2]。

生物碱是玛卡中一类重要的次级代谢物质,具有镇痛、消炎、降压、抗菌及抗癌等多种生理活性[3-4]。2000年Zheng[5]等在玛卡根中发现了一类结构独特的生物碱-玛卡酰胺。2002年Muhammad[6],2004年Zhao[7],2005年Mccollom[8],2014年Chain[9]等相继发现新玛卡酰胺,目前已被鉴定的达21种,作为玛卡鉴定和标记的化合物,玛卡酰胺具有抗疲劳、改善性功能等作用[5]。芥子油苷是包含硫酸和硫代葡萄糖配基的氨基酸衍生物[10],当组织和细胞受到损伤时容易降解成腈类、硫氰酸酯、异硫氰酸酯等,不过其降解产物仍具有生物活性,如:抗癌、抗氧化、抗疲劳等[2,11-12]。

目前关于玛卡中生物碱以及芥子油苷的提取研究较多,如罗堾子[13]和杜广香[14]等采用超声波微波辅助和超声波对玛卡生物碱提取进行了研究,郝利民[15]和徐涓[16]等分别研究了甲醇和水对玛卡中芥子油苷的提取;同时随着玛卡批准为新资源食品,在玛卡片、玛卡粉、玛卡胶囊和玛卡饮料等[17]食品相继开发之后,酒作为有效成分的良好载体,玛卡酒[18-19]也成为研究热点。不过关于生物碱和芥子油苷同时优化提取的研究较少,特别是以食用酒精为载体的研究尚未见报道,同时也缺乏对生物碱和芥子油苷在酒中贮藏稳定性的研究。因此本文采用比云南玛卡(生物碱46.01±1.20 mg/100 g,芥子油苷598.01±0.99 mg/100 g,玛卡酰胺26.59±0.33 mg/100 g,干重)富含更多有效成分的澳大利亚有机黄玛卡为原料(生物碱55.37±0.73 mg/100 g,芥子油苷617.13±1.04 mg/100 g,玛卡酰胺37.88±0.60 mg/100 g,干重),对生物碱和芥子油苷的优化提取以及在玛卡酒中的稳定性进行研究,对于其开发利用、提高经济价值具有重要意义。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

澳大利亚有机黄玛卡粉 上海市中福集团有限公司;95%食用酒精(等级为GB10343-2008中的优级)上海铨泽实业有限公司;53°白酒(等级为GB26760-2011中的优级)贵州博鸣酒业有限公司;N-苄基-十六碳酰胺 色谱纯 天津药明康德有限公司;苦参碱、黑芥子硫苷酸钾水合物 色谱纯,甲醇、乙腈 色谱级,溴百里酚蓝 化学纯,上海安谱实验科技股份有限公司;甲醇、盐酸、氯仿、磷酸 分析纯,氯化钯、氢氧化钠、磷酸氢二钠、磷酸氢钠、无水硫酸钠、羧甲基纤维素钠 化学纯,国药集团化学试剂有限公司。

2695 Quattro Micro型液相色谱质谱联用仪(配套MassLynxV 4.1型数据采集及处理软件)美国Waters公司;Zorbax XDB C-18色谱柱Agilent公司;UV2300紫外可见分光光度计上海美谱达仪器有限公司;FE20pH计梅特勒-托利多仪器有限公司;Avanti J-26xP冷冻离心机贝克曼库尔特公司;R250旋转蒸发仪郑州长城科工贸有限公司;WH-2微型旋涡混合仪上海沪西分析仪器厂有限公司;E5-20A急速冷冻柜意大利Tecnomac有限公司;JES M5硅藻土板框过滤机意大利EBARA有限公司。

1.2实验方法

1.2.1玛卡中有效成分的优化提取

1.2.1.1食用酒精浓度对生物碱和芥子油苷提取率的影响根据市售食用酒精浓度95%,取澳大利亚有机黄玛卡粉按料液比10∶100(g/mL)分别量取由95%食用酒精配制的浓度为55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%的食用酒精,加盖密封避光提取3d。

1.2.1.2料液比对生物碱和芥子油苷提取率的影响取澳大利亚有机黄玛卡粉分别按料液比2L、4、6、8、10 mg/mL量取1.2.1.1中最佳浓度的食用酒精,加盖密封避光提取3 d。

1.2.1.3提取天数对生物碱和芥子油苷提取率的影响取澳大利亚有机黄玛卡粉按1.2.1.2中最佳料液比量取1.2.1.1中最佳浓度的食用酒精,加盖密封避光分别提取3、4、5、6、7、8 d。

1.2.2玛卡酒的制备

1.2.2.1提取澳大利亚有机黄玛卡粉与食用酒精按照1.2.1中的最优提取条件放入提取罐中提取,得到提取液。

1.2.2.2浓缩提取液采用旋转蒸发仪,在40 ℃条件下浓缩至原体积1/5。

1.2.2.3低温冷沉浓缩液在-15～-10 ℃下冷沉24 h,过滤得到精制的浓缩液。

1.2.2.4调制精制后的浓缩液与优选53°白酒按照2∶98的体积比混合,经-15～-10 ℃低温冷沉24 h和过滤得到澄清玛卡酒,其中浊度值为(0.62±0.13)EBC,食用酒精含量<2%。

1.2.3生物碱测定

1.2.3.1苦参碱标准曲线绘制参照甘瑾等[2]方法。

1.2.3.2玛卡粉中生物碱测定取1 g玛卡粉用20 mL甲醇浸提24 h,过滤,同法提取3次,合并提取液、浓缩为浸膏,用质量分数2% HCl洗涤溶解,共洗涤3次,合并酸液,5000 r/min离心10 min,取上清液用质量分数10%的NaOH调节pH至10,再用等体积氯仿萃取3次,合并萃取液、浓缩定容至10 mL。取其中1 mL,按标准曲线处理方法于414 nm测吸光度,代入回归方程得玛卡粉中生物碱含量。

1.2.3.3提取液中生物碱测定取1.2.2.1中提取液10.0 mL按照1.2.3.2处理,最后定容至10 mL。取其中1 mL,按标准曲线处理方法于414 nm测吸光度,代入回归方程得提取液中生物碱含量。

1.2.4芥子油苷测定

1.2.4.1黑芥子硫苷酸钾标准曲线绘制参照郝利民等[11]方法。

1.2.4.2玛卡粉中芥子油苷测定取1 g玛卡粉用20 mL甲醇提取24 h,过滤,同法提取3次,合并提取液。取其中1.0 mL,按标准曲线处理方法于540 nm测吸光度,代入回归方程得玛卡粉中芥子油苷含量。

1.2.4.3提取液中芥子油苷测定取1.2.2.1中提取液1.0 mL,按标准曲线处理方法于540 nm测吸光度,代入回归方程得提取液中芥子油苷含量。

1.2.5玛卡酰胺测定HPLC条件参照McCollom等人[8]的方法,调整参数如下:Zorbax XDB C-18反相柱(250 mm×4.6 mm,5μm);进样体积20 μL;流速1.0 mL/min;柱温40 ℃;流动相A为水,B为乙腈;波长210 nm。进行梯度洗脱,洗脱参数如表1所示。

1.2.5.1N-苄基-十六碳酰胺标准曲线绘制准确配制1 mg/mL的N-苄基-十六碳酰胺标准品溶液,再分别配制浓度为2、10、25、50、100、150 μg/mL的标准品溶液,采用HPLC在210 nm处测定峰面积,绘制标准曲线。

1.2.5.2玛卡粉中玛卡酰胺测定取5 g玛卡粉,加入15 mL甲醇(色谱级)超声10 min,重复4次,合并提取液,7000 r/min离心10 min,60 ℃旋转蒸发浓缩至浸膏,用甲醇(HPLC)溶解定容至6 mL,采用HPLC在210 nm处测定峰面积,代入回归方程得玛卡粉中玛卡酰胺含量。

表1　梯度洗脱参数

1.2.5.3提取液中玛卡酰胺测定取提取液30 mL,60 ℃旋转蒸发浓缩至浸膏,用甲醇(HPLC)溶解定容至5 mL,采用HPLC在210 nm处测定峰面积,代入回归方程得提取液中玛卡酰胺含量。

1.2.6有效成分的提取率、得率计算公式

P=C1×V1×100/M1

S=C2×V2×100/M2

式中:P-有效成分提取率(%),C1-提取液中有效成分浓度(mg/mL),V1-提取液体积(mL),M1-玛卡粉中有效成分含量(mg),S-有效成分保存率(%),C2-浓缩液/玛卡酒中有效成分浓度(mg/mL),V2-浓缩液/玛卡酒体积(mL)。

1.2.7数据处理实验数据全都重复3次,结果表示为平均值±标准偏差(n=3)。采用Excel(2007版)和SPSS19.0软件对结果进行数据处理和显著性差异分析(p<0.05)。

2　结果与讨论

2.1标准曲线和玛卡酰胺高效液相色谱图

从图1可知,苦参碱浓度(mg/mL)与吸光度的线性回归方程为Y=88.6475C-0.0072,R2=0.9992,在0～0.017 mg/mL质量浓度范围内线性关系良好;黑芥子硫苷酸钾浓度(μmol/L)与吸光度的线性回归方程为Y=0.0010C-0.0002,R2=0.9995,在0～993 mg/mL质量浓度范围内线性关系良好;N-苄基-十六碳酰胺浓度(μg/mL)与峰面积的线性回归方程为Y=34256.4618C-3046.1062,R2=0.9994,在0～150 μg/mL浓度范围内线性关系良好。

图1　苦参碱、黑芥子硫苷酸钾和N-苄基-十六碳酰胺的标准曲线Fig. 1　Standard curves of matrine,sinigrin and n-benzylhexadecanamide

图2　N-苄基-十六碳酰胺HPLC色谱图(150 μg/mL)Fig.2　HPLC chromatogram of N-benzylhexadecanamide(150 μg/mL)

图4　玛卡中玛卡酰胺的HPLC色谱图Fig. 4　HPLC chromatogram of macamides in maca 注:1～8经质谱分析,分别对应图3中的11、8、10、3、6、5、1、2,其中7为N-苄基-十六碳酰胺。

图3　玛卡中玛卡酰胺HPLC色谱图[8]Fig.3　HPLC chromatogram of macamides in maca[8] 注:1.N-苄基-十六碳酰胺,2.N-苄基-(9Z)十八碳烯酰胺,3.N-苄基-(9Z,12Z)十八碳二烯酰胺,4.N-苄基-硬脂酸酰胺,5.N-(3-甲氧基苯苄)-十六碳酰胺,6.N-苄基-十五碳酰胺,7.N-苄基-十七碳酰胺,8.N-苄基-(9Z,12Z,15Z)十八碳三烯酰胺,9.N-(-甲氧基苯苄)-(9Z)十八碳烯酰胺,10.N-(-甲氧基苯苄)-(9Z,12Z)十八碳二烯酰胺,11.N-(-甲氧基苯苄)-(9Z,12Z,15Z)十八碳三烯酰胺。

2.2玛卡中生物碱和芥子油苷的提取

2.2.1食用酒精浓度对生物碱和芥子油苷提取率的影响从图5可以看出,随着食用酒精浓度的增加,生物碱的提取率总体呈上升趋势,芥子油苷提取率变化平缓,无显著性差异。其中生物碱提取率随酒精浓度增加而上升,这与溶剂相似相溶的理论相符合[20],溶剂为水和酒精的混合溶液,水的极性大于酒精的极性,酒精浓度越高,溶液极性相对越弱,生物碱等弱极性物质的溶解度越高。与罗堾子等[16]对玛卡片中生物碱和芥子油苷的提取采用40%～60%乙醇体积分数相比,结果类似。当酒精浓度为85%和90%时,生物碱和芥子油苷的提取率均最高且无显著性差异,但是酒精浓度越高,浓缩时间和经济成本更低,故选择食用酒精浓度90%为佳。

图5　食用酒精浓度对生物碱和芥子油苷提取率的影响Fig.5　Effect of alcohol contents on the extraction yields of alkaloids and glucosinolates注:小写字母和大写字母分别表示生物碱和芥子油苷的统计学显著性差异(p<0.05),图6、图7、表2、表4同。

2.2.2料液比对生物碱和芥子油苷提取率的影响

从图6可以看出,不同料液比对玛卡中生物碱和芥子油苷提取率具有一定影响,生物碱和芥子油苷的提取率均随料液比的增加总体有降低趋势,不过变化较为平缓。与杜广香、郝利民等人[17-19]以甲醇、乙醇和水为溶剂,对云南玛卡中生物碱、芥子油苷用超声和微波提取的结果类似。一般来说,增加提取溶剂会提高提取率。当料液比为6 mg/mL和8 mg/mL时,生物碱的提取率最高,料液比为4 mg/mL时芥子油苷提取率达到最高,以生物碱和芥子油苷的提取率为优化指标,料液比6和10 mg/mL时二者提取率最高且没有显著性差异。在恒温过程中,溶剂的量过大,会消耗过多能量,为后续浓缩工序带来不便并增加生产成本。综合考虑提取率和溶剂回收问题,选择料液比10 mg/mL最佳。

图6　料液比对生物碱和芥子油苷提取率的影响Fig.6　Effect of the ratio of maca powder to alcohol volume on the extraction yields of alkaloids and glucosinolates

2.2.3提取天数对生物碱和芥子油苷提取率的影响从图7可以看出,在3～8 d内随时间增加,生物碱和芥子油苷的提取率总体增加,芥子油苷提取率的增长较生物碱明。一般来说,提取率会随着提取时间的增加而增加,不过时间越长,能耗和成本越高。图中第7 d时,生物碱提取率有稍微降低,第6 d和8 d时,生物碱和芥子油苷提取率最高且无显著性差异,从节省时间和能耗考虑,选择提取天数6 d更佳。

图7　提取天数(d)对生物碱和芥子油苷提取率的影响Fig.7　Effects of extration time(d) on the extraction yields of alkaloids and glucosinolates

2.3玛卡酒中有效成分的检测

表2　玛卡粉、提取液、浓缩液和玛卡酒中有效成分(n=3)

表3　玛卡酒工艺过程中有效成分的提取率及保存率(%)

由表2可知,在鲜重状态下,澳大利亚玛卡粉中的生物碱、芥子油苷和玛卡酰胺含量较云南玛卡粉中高,对其中水分含量进行测定发现澳大利亚玛卡中水分为7.23%,云南玛卡中水分为16.26%。云南玛卡中水分含量高于澳大利亚玛卡,澳大利亚中生物碱、芥子油苷和玛卡酰胺含量均高于云南玛卡,并且具有显著性差异(p<0.05)。其中芥子油苷与艾中[21]用70%甲醇提取不同产地玛卡中芥子油苷的结果相似;比徐涓[19]用水提取新鲜玛卡中芥子油苷的含量高3倍,原因或许是由于本实验选用的玛卡粉干燥样品中水分含量较一般新鲜样品低,结果使芥子油苷含量的实际值较高。澳大利亚玛卡粉中玛卡酰胺含量与Ganzera[22]用反相高效液相测定玛卡粉的结果类似。参照1.2.6中提取率计算公式,表3中提取液中生物碱、芥子油苷和玛卡酰胺的提取率分别为91.10%±1.30%、92.28%±1.64%、90.50%±1.86%,均大于90%,说明食用酒精对玛卡中有效成分的提取效果良好。参照1.2.6中保存率计算公式,浓缩液中各有效成分均达90%以上,说明温度对生物碱、芥子油苷和玛卡酰胺的稳定性具有一定影响。经调制工艺制得的玛卡酒中生物碱和玛卡酰胺的保存率分别为80%以上,芥子油苷为68.33%±1.04%,与浓缩液相比较,损失率为22.01%,原因一方面可能是在冷沉过程中不溶性成分析出与芥子油苷结合,过滤时被截留而造成的损失有关;另外一方面是芥子油苷比较容易降解[2]。

2.4玛卡酒中有效成分的贮藏稳定性

从表4可知,玛卡酒在半年的贮藏期中,生物碱、芥子油苷和玛卡酰胺的含量总的来说随时间的增加而降低,但在前2个月内均无显著性差异。其中第3个月测定的芥子油苷含量有大幅度的降低,这与芥子油苷容易降解的特性不无相关,生物碱在第5个月开始有较高含量的损失,而对于玛卡酰胺,在6个月内含量没有显著性差异,稳定性较好。

表4　半年贮藏期中玛卡酒

3　结论

本研究以澳大利亚有机黄玛卡粉为原料,用食用酒精提取玛卡粉中的生物碱和芥子油苷,提取液经浓缩、与白酒调制、冷沉和过滤等工序制得玛卡酒。以玛卡中生物碱和芥子油苷的提取率为优化指标,得到佳提取条件为食用酒精浓度90%,料液比10 mg/mL,提取天数6 d,提取液中生物碱、芥子油苷和玛卡酰胺的提取率分别为91.10%±1.30%、92.28%±1.64%、90.50%±1.86%。浓缩液中生物碱、芥子油苷和玛卡酰胺的保存率分别为92.52%±2.26%、90.34%±3.57%、90.31±0.98%;玛卡酒中生物碱、芥子油苷和玛卡酰胺的保存率分别为81.20%±1.26%、68.33%±1.04%、81.76%±0.78%。玛卡酒在半年的贮藏期内,芥子油苷含量在第3个月内有很大的减少,而生物碱含量是在第5个月内有较大降低,需要指出的是玛卡酰胺在6个月内的稳定性良好。

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Extraction of alkaloids and glucosinolates from Maca and stability in Maca Liquor

ZHAO Lin-min,HE Yu-ning,SHEN Hui,NING Wei-wei,TAO Ning-ping*

(College of Food Science,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China)

Australia organic maca powder was used as raw material,active substances were extracted by edible alcohol. Maca liquor was prepared by concentration of extracting solution,modulation with liquor,low temperature sedimentation and filtration. Optimum extraction technology of active substances in maca powder was investigated by optimizing alcohol concentration,solid-liquid ratio and extraction time based on extracting yields of alkaloids and glucosinolates,and then the contents and stability of alkaloids,glucosinolates and macamides were monitored. The optimum extracting conditions were as follows:edible alcohol concentration 90%,ratio of material to solvent 10 mg/mL,and soaking time 6 d. Under these conditions,the extraction yields of alkaloids,glucosinolates and macamides were 91.10%±1.30%,92.28%±1.64% and 90.50%±1.86%,respectively. Preservation yields of alkaloids,glucosinolates and macamides were 81.20%±1.26%,68.33%±1.04% and 81.76%±0.78%,respectively. Glucosinolates were decreased most and followed by alkaloids,macamides had the best stability in maca liquor within 6 months in the stability test for maca liquor in half a year.

Maca liquor;alkaloid,glucosinolate;macamide;stability

2015-05-15

赵林敏(1990-)，女，在读硕士研究生，研究方向：食品营养与品质，E-mail：2767620467@qq.com。

陶宁萍(1968-)，女，博士，副教授，研究方向：食品营养与风味，E-mail：nptao@shou.edu.cn。

上海市教委“食品质量与安全”重点学科建设项目(J50704)；“江苏省国家长江珍稀鱼类工程技术研究中心培育点”项目；上海市科委工程中心建设：上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心(11DZ2280300)。

TS207.3

A

1002-0306(2016)01-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.01.000